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ヒト増殖細胞核抗原構造-機能相関の探索

人增殖细胞核抗原结构与功能关系的探索

基本信息

批准号：
07772151
负责人：
森岡弘志
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07772151/
关键词：
増殖細胞核抗原 PCNA RFC DNA ポリメラーゼδ 蛋白質工学 T7RNAポリメラーゼ

项目摘要

ヒト増殖細胞核抗原(PCNA)の構造機能相関を探索することを目的として、蛋白質工学的手法により作製したヒトPCNA変異体と複製因子C(RFC)およびDNAポリメラーゼδ(polδ)との相互作用を調べた。以下に、本研究によって得られた新たな知見等の成果を示す。1.PCR法を応用した部位特異的変異法により、ヒトPCNA遺伝子に変異を導入した。標的部位は、出芽酵母PCNAの結晶構造解析から明らかになった(1)C末端近傍の釣針型ループ構造内に位置する酸性アミノ酸クラスター、塩基性アミノ酸、および疎水性側鎖をもつIle255、ならびに(2)リング状構造の内側をプラス電荷で覆っている1分子あたり9残基の塩基性アミノ酸とし、これらを1残基あるいは複数残基同時にアラニンに変換した。これらすべてのPCNA変異体は、天然型PCNAと同様に、T7RNAポリメラーゼ系により大腸菌で大量発現させ、各種カラムクロマトグラフィーにより精製され、培養液1L当たりそれぞれ約30mgのサンプルとして調製された。2.RFCおよびpolδとの相互作用を調べたところ、C末端のループ構造はRFCとの相互作用部位であることが示された。特に、Ile255は重要部位であることが明らかにされた。さらに、これらの部位はpolδとの相互作用には関与していないことがわかった。また、リング状構造内側の塩基性アミノ酸を複数残基同時にアラニンに置換した変異体では、RFCとの相互作用は天然型同様であったが、天然型PCNAがもつpolδのDNA合成活性の促進効果に大きな影響を見られた。すなわち、これら塩基性アミノ酸は協調的にDNAと相互作用することが示された。

To explore the relationship between the structure and function of PCNA and the regulation of PCNA by protein engineering The results of this study are shown below. 1. PCR method is used for site-specific differentiation, and PCNA gene differentiation is introduced. Crystal structure analysis of budding yeast PCNA at the target site: (1) Acidity loss of acid, basicity loss of acid, basicity loss of water-based side lock, Ile255,(2) Inner-side charge loss of budding yeast PCNA: (1) Acidity loss of acid, basicity loss of acid, basicity loss of 9 residues near C-terminal The first residue was replaced by the second residue. These are PCNA variants, native PCNA, T7RNA variants, Escherichia coli, and 1L of culture medium. 2. The interaction between RFC and polδ is regulated, and the interaction between RFC and pol δ is regulated by C terminal structure. Special, Ile255 important partsさらに、これらの部位はpolδとの相互作用には関与していないことがわかった。The effect of multiple residues on the DNA synthesis activity of PCNA was also observed. The DNA interaction between the two genes is coordinated.