ヒト増殖細胞核抗原構造-機能相関の探索

人增殖细胞核抗原结构与功能关系的探索

基本信息

批准号：
07772151
负责人：
森岡弘志
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07772151/
关键词：
増殖細胞核抗原 PCNA RFC DNA ポリメラーゼδ 蛋白質工学 T7RNAポリメラーゼ

项目摘要

ヒト増殖細胞核抗原(PCNA)の構造機能相関を探索することを目的として、蛋白質工学的手法により作製したヒトPCNA変異体と複製因子C(RFC)およびDNAポリメラーゼδ(polδ)との相互作用を調べた。以下に、本研究によって得られた新たな知見等の成果を示す。1.PCR法を応用した部位特異的変異法により、ヒトPCNA遺伝子に変異を導入した。標的部位は、出芽酵母PCNAの結晶構造解析から明らかになった(1)C末端近傍の釣針型ループ構造内に位置する酸性アミノ酸クラスター、塩基性アミノ酸、および疎水性側鎖をもつIle255、ならびに(2)リング状構造の内側をプラス電荷で覆っている1分子あたり9残基の塩基性アミノ酸とし、これらを1残基あるいは複数残基同時にアラニンに変換した。これらすべてのPCNA変異体は、天然型PCNAと同様に、T7RNAポリメラーゼ系により大腸菌で大量発現させ、各種カラムクロマトグラフィーにより精製され、培養液1L当たりそれぞれ約30mgのサンプルとして調製された。2.RFCおよびpolδとの相互作用を調べたところ、C末端のループ構造はRFCとの相互作用部位であることが示された。特に、Ile255は重要部位であることが明らかにされた。さらに、これらの部位はpolδとの相互作用には関与していないことがわかった。また、リング状構造内側の塩基性アミノ酸を複数残基同時にアラニンに置換した変異体では、RFCとの相互作用は天然型同様であったが、天然型PCNAがもつpolδのDNA合成活性の促進効果に大きな影響を見られた。すなわち、これら塩基性アミノ酸は協調的にDNAと相互作用することが示された。

为了寻找人类增殖细胞核抗原（PCNAS）的结构功能相关性，研究了由蛋白质工程方法与复制因子C（RFC）和DNA聚合酶δ（POLΔ）产生的人PCNA突变体之间的相互作用。从这项研究中获得的新发现和其他结果的结果如下所示。 1。通过使用PCR定向突变方法将突变引入人PCNA基因中。目标位点为（1）ILE255，它具有酸性氨基酸簇，碱性氨基酸和位于C末端钩形环内结构内的疏水侧链，如晶体结构分析，晶体结构分析了发芽的酵母菌PCNA的晶体结构分析，并且（2）在每个分子上均构成了9个基本氨基酸的基本氨基酸，并且覆盖了碱性的碱性，并覆盖了这些碱性，并且这些结构均覆盖了这些含量，并且这些结构均覆盖了这些含量，并且这些结构均覆盖了这些含量，并且这些结构均覆盖了这些含量，并且这些结构均覆盖了这些电源型，并且这些是型号的，并且这些结构均覆盖了这些电源含量，这些含有环形的结构，这些含有环形的结构，这些含有环形的结构。或多个残留物。所有这些PCNA变体使用T7RNA聚合酶系统在大肠杆菌中大量表达，类似于天然PCNA，并通过各种色谱柱色谱法纯化，并以每升培养基的每种样本样品的大约30毫克制备。 2。检查与RFC和POLδ的相互作用表明C末端环结构是与RFC相互作用的位点。特别是，据透露ILE255是一个重要的地点。此外，发现这些位点与POLδ相互作用不参与。此外，在一个突变体中，在该突变体中，多个残基将碱性结构内的碱性氨基酸同时被丙氨酸取代，与RFC的相互作用与天然PCNA相似，但发现它是促进POLδ的DNA合成活性的主要作用，而Polδ自然出现了PCNA。也就是说，这些碱性氨基酸已被证明以协调的方式与DNA相互作用。