紫外線損傷塩基を含む化学合成オリゴヌクレオチドと修復酵素との相互作用の解析

含有紫外线损伤碱基的化学合成寡核苷酸与修复酶之间相互作用的分析

基本信息

批准号：
05270201
负责人：
森岡弘志
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

以下に、今年度得られた新たな知見等の成果を示す。1.適当な保護基を導入したチミジン2量体に紫外線照射を行なった後、3'-ホスホアミダイト体とすることによりチミンダイマーを含んだ結合ユニットを合成した。2.チミンダイマー部分のリン酸基をホスホロチオエート結合に修飾したオリゴヌクレオチド(dGCACGT〔ps〕TGCACG、T〔ps〕T:ホスホロチオエート結合を有するチミンダイマー誘導体)およびその相補鎖(dCGTGCAACGTGC)を化学合成し、2本鎖とした後、T4エンドヌクレアーゼVの基質として用いた。なお、解析にはリン酸結合の2種類のジアステレオ異性体(Rpホスホロチオエート体、およびSpホスホロチオエート体)を用いた。PDグリコシラーゼ活性の反応速度定数を求めると、Km値はRpホスホロチオエート体では7.1x10^<-9>M、Spホスホロチオエート体で5.3x10^<-8>Mとなり、Rpホスホロチオエート体の方がSpホスホロチオエート体よりも酵素に対する親和性が高いことがわかった。すなわち、チミンダイマー部分のリン酸残基が酵素と相互作用していることが明らかにされた。3.上記の結合ユニットを用いて、鎖長30merのチミンダイマーを含むオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖を合成した。これらを基質としてメチル化保護実験を行い、T4エンドヌクレアーゼVが特異的に認識しているDNA領域の検索およびその結合様式の解析を試みた。その結果、2本鎖DNA中のチミンダイマー部位の相補鎖側アデニン塩基の3位のメチル化が特異的に阻止された。すなわち、T4エンドヌクレアーゼVが基質DNAのチミンダイマー部位に対してマイナーグルーブ側から結合していることが明らかにされた。

以下是今年获得的新发现和其他结果的结果。 1。在胸苷二聚体上使用适当的保护组进行了紫外线照射后，通过将其转换为3'-磷酸胺的结合单元，合成了含有胸腺二聚体的结合单元。 2。寡核苷酸（DGCACGT [PS] TGCACG，T [PS] T：具有磷酸胸酯键）及其互补链（DCGTGCAACGTGC）（DCGTGCAACGTGC）的胸骨二聚体衍生物（DCGTGCAACGTGC），其中胸骨二聚体的磷酸盐二聚体是对胸骨二聚体的磷酸盐群的改造，以使磷酸化的键合构成了磷酸的粘结和磷酸化的和它的磷酸化型和和它的胰蛋白酶和和它的磷酸化症状，并在其中，并在其磷酸二聚体中，并在其磷酸二聚体中和phosserate键入和它的磷酸盐。（DCGTGCAACGTGC）化学合成，在双重绞合后，将其用作T4核酸内核酸酶V的底物。用于分析，使用了两种类型的非映异构体（RP磷酸胸酯和SP磷酸盐磷酸盐）的磷酸盐键。当确定PD糖基化酶活性的反应速率常数时，对于SP磷酸硫酸磷酸盐形式的RP磷酸硫酸RP磷酸硫酸磷酸盐形式的KM值为7.1x10^<-9> m，并且发现RP磷酸座酸盐形式具有更高的亲和力，可用于Spphossymes and zymes and zymes antspphosphosterate。也就是说，揭示了胸腺二聚体部分中的磷酸盐残基与酶相互作用。 3。使用上述结合单元，合成了含有30 mer链长度的胸腺二聚体及其互补链的寡核苷酸。使用这些作为底物，我们进行了甲基化保护实验，并试图搜索由T4核酸内切酶V特异性识别的DNA区域并分析其结合模式。结果，在双链DNA中的胸腺二聚体位点的互补滞留的腺嘌呤碱的位置3被特异性封闭。也就是说，据揭示了T4核酸内切酶V与小凹槽侧的底物DNA的胸腺二聚体位点结合。