紫外線損傷塩基を含む化学合成オリゴヌクレオチドを用いたDNA修復機構の研究

使用含有紫外线损伤碱基的化学合成寡核苷酸研究DNA修复机制

• 批准号: 08280201
• 负责人: 森岡 弘志
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08280201/
• 关键词: 紫外線損傷DNA; (6-4)光産物; オリゴヌクレチオド; ファージディスプレイシステム; バイオセンサー; 1本鎖抗体

本研究の代表者らは,(6-4)光産物を特異的に認識する1本鎖抗体(64M5scFv抗体)をもとに,ファージディスプレイシステムを用いて,結合能や抗原特異性の異なる新規抗体分子の作製を試みた.以下に,今年度得られた新たな知見等の成果を示す.(1)64M5scFv抗体遺伝子へのランダム変異導入法はMn^<2+>を用いたPCRを選択した.変異型64M5scFv抗体を分子表面に提示したファージライブラリーを調製した後,バイオパニングによるアフィニティセレクションを行った.(2)バイオパニングおよび結合活性の測定の際に抗原となる(6-4)光産物あるいはDewar型異性体等の光損傷を含むオリゴヌクレオチド(d8mer,d(CAAT[]TAAG):T[]T部位は(6-4)光産物あるいはDewar型異性体等の光損傷)は,化学合成し紫外線照射後,高速液体クロマトグラフィーで分離,精製して得られた.(3)得られたscFv抗体の評価にはバイオセンサーシステム(BIAcore)を用い,反応速度論的な解析を行うことを計画した.まず,天然型の64M5Fabおよび64M5scFvと(6-4)光産物を含むオリゴヌクレオチドとの相互作用の解析を行い,それぞれのkassおよびkdissを測定し解離定数Kdを求めたところ,(6-4)光産物を含むd8merに対する64M5scFvのKd値(4.5±0.8x10^<-10>)は64M5FabのKd値(1.5±0.2x10^<-10>)とほぼ等しいことが分かった.すなわち,この解析,評価法は抗体分子の改変を進めていく上で有効であることが確認された.(4)現在,(6-4)光産物あるいはDewar型異性体を含むオリゴヌクレオチドを抗原として,バイオパニングを繰り返し行っている.

The representative of this study is to recognize the specificity of (6-4) photoproducts and to try to make new antibody molecules (64M5 scFv antibody). The following is a summary of the achievements made this year. (1) 64M5 scFv antibody gene expression vector was selected by PCR using different methods. 64M5 scFv molecular surface prompt, after the modulation, the change in the color of the screen. (2)When determining the binding activity, antigen is separated from the photo-damaged (6-4) photo-product by UV irradiation, and the photo-damaged (d8mer,d(CAAT[]TAAG):T[]T site is separated from the photo-damaged (6-4) photo-product by UV irradiation. (3)The evaluation of scFv antibody was carried out by using BIAcore, and the analysis of anti-scFv antibody was carried out. In addition, the interaction analysis of the natural 64M5 Fab and 64M5 scFv (6-4) photoproducts was carried out, and the dissociation Kd value of the 64M5 scFv (4.5±0.8x10^ ) and the Kd value of the <-10>64M5 Fab (1.5±0.2x10 ^<-10>) were determined. The analysis and evaluation of antibody molecule modification were carried out. (4)Now,(6-4) photoproducts contain the Dewar heteromorph and the antigen.

项目成果

Morioka,H.: "Structure and function of proliferating cell nuclear antigen (PCNA)." Seikagaku. 68・9. 1542-1548 (1996)

Morioka, H.：“增殖细胞核抗原（PCNA）的结构和功能。” Seikagaku 1542-1548（1996）。

Todo,T.: "Flavin adenine dinucleotide as a choromophore of the Xenopus (6-4) photolyase." Nucleic Acids Res.25・4. 764-768 (1997)

Todo, T.：“黄素腺嘌呤二核苷酸作为非洲爪蟾 (6-4) 光裂合酶的脉络团。”核酸研究 25・4 (1997)。