イソフラボン生合成反応を触媒するシトクロムP-450の遺伝子クローニング

催化异黄酮生物合成反应的细胞色素P-450基因克隆

• 批准号: 06780459
• 负责人: 袴塚 高志
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780459/
• 关键词: シトクロムP-450; 転位反応; クローニング; イソフラボン; 生合成; 培養細胞

本研究の目的は、イソフラボノイド生合成経路の初発段階である芳香環転位反応を触媒しているシトクロムP-450系酵素:2-Hydroxyisoflavanone Synthaseについて、そのタンパクをコードしている遺伝子をクズ(Pueraria lobata)の培養細胞よりクローニングし、その反応機構及び制御機構についてさらに詳細な検討を加えることにある。そして、あらゆるP-450に保存されているC末端寄りのアミノ酸配列をもとにPCRを行い、クズ培養細胞において発現されているP-450のC末端断片より成るミニライブラリーを作製し、サイズあるいはエリシターへの感受性などを手掛かりにスクリーニングし、最終的には何らかの発現系を用いて完全長の酵素タンパクを作製して活性を確認する戦略を立てた。まず、保存性の極めて高いヘム結合領域のアミノ酸配列ProPheGly x Gly x Arg x Cys x Gly(xは保存性の低いアミノ酸)のうちProPheGly x Gly x Argの部分をもとにして多くの縮重を含むDegenerate Primerを作製し、さらにpolyA配列に相補的なpoly(dT)に制限酵素部位(Xba I)を連結させたプライマーとのセットでPCRを行った。このPCR反応生成物をアガロース電気泳動により分析してみたところ、C末端からヘム結合部位までの距離に相当する400-600bp付近のスメア-なバンドが観察された。この大きさのDNAをゲルから回収し、T4 DNA polymeraseにより平滑末端化した後、Xba Iで消化して片側にXba I Cohesive Endを導入した。これをSma IとXba Iで切断したベクター(pBluescript II SK^-)とライゲーションさせ、大腸菌DH 5αF'にトランスフォームし、アンピシリン耐性を指標にトランスフォーメーションの効率を確認したが、満足のいく結果は得られなかった。現在、PCR産物及びベクターの精製を進め、スクリーニングへと進むに値するライブラリーの作製に勉めている。

The purpose of this study is to investigate the catalytic mechanism of aromatic ring position reaction in the initial stage of biosynthesis pathway:2-Hydroxyisoflavone Synthase, Pueraria lobata and culture cells. C terminal fragment of P-450 is preserved in the culture medium, PCR is carried out, and cell culture is carried out. C terminal fragment of P-450 is produced in the culture medium. Finally, the enzyme activity was confirmed by the complete enzyme production system. In addition, the preservation of the high end of the binding domain and the use of acid alignment ProPheGly x Gly x Arg x Cys x Gly(x) and the low end of the preservation of acid), all parts of ProPheGly x Gly x Arg are reduced in weight, including the Degenerate Primer, and the polyA alignment is complementary to the poly(dT) restriction enzyme site (Xba I). The PCR products were analyzed by electrophoresis, and the distance between the C-terminal and C-terminal binding sites was approximately 400-600bp. The DNA sequence of this gene must be reversed, T4 DNA polymerase must be smoothly terminated, Xba I must be digested, Xba I must be cohesively terminated. For example, Sma I and Xba I can be cut off from each other (pBluescript II SK^-), and E. coli DH5 α F', and the resistance index can be used to determine the rate of change and the results can be obtained. Now, PCR products and the purification of the enzyme are in progress, and the enzyme is in progress.

项目成果

T.Hakamatsuka: "Isoflavone Synthase from Cell Suspension Cultures of Pueraria lobata" Chem.Phavin.Bull.38. 1942-1945 (1990)

T.Hakamatsuka：“来自葛根细胞悬浮培养物的异黄酮合酶”Chem.Phavin.Bull.38。

T.Hakamatsuka: "Biotechnology in Agricuture and Forestry,Vol.28" Springer-Verlag Berlin, (1994)

T.Hakamatsuka：“农业和林业生物技术，第 28 卷”Springer-Verlag Berlin，（1994 年）

M.F.Hashim: "Reaction Mechanism of Oxidative of Flaahone in Isoflavone Biosynthesis" FEBS Letters. 271. 219-222 (1990)

M.F.Hashim：“异黄酮生物合成中 Flaahone 氧化的反应机制”FEBS Letters。

T.Hakamatsuka: "P-450-Dependent Oxidative Rearrangement in Isoflavone Biosynthesis" Tetrahedron. 47. 5969-5978 (1991)

T.Hakamatsuka：“异黄酮生物合成中 P-450 依赖性氧化重排”四面体。

T.Hakamatsuka: "Recent Progress in Studies of the Biosynthesis of Isoflavonoids" J.Plant Res.Special Issue. 3. 129-144 (1993)

T.Hakamatsuka：“异黄酮类生物合成研究的最新进展”J.Plant Res.特刊。