鶏Fas抗原遺伝子のフローニングによるマレック病ワクチンの作用機序の解明

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現在鶏Fas遺伝子のクローニングを進めている。2日齢鶏の胸腺よりフェノール・グアニジン法により調製したRNAを用いてcDNAライブラリーを調製した。ライブラリーの作成には発現ファージベクターであるλEX/loxを用いた。このライブラリをジゴキシゲン(DIG)標識したマウスFas cDNAを用いてプラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングして(約400,000プラーク)鶏Fas遺伝子cDNAのクローニングを試みた。ハイブリダイゼーションの条件はFas遺伝子が既にクローニングされているヒト、マウス、ラットにおいてもお互いの相同性約65%と低く、鶏ではさらに相同性が低いことが予想され、約55%の相同性を想定した。スクリーニングの結果、数種類の陽性クローンが得られ、2次および3次クローニングを行い、最終的に5個のcDNAクローンを得た。また同時に上記の方法で鶏胸腺の他、脾臓、マレック病腫瘍由来株化細胞(MSB1)よりcDNAを調製して、ヒト、ラット、マウスFas遺伝子で相同性の高い塩基配列よりデザインしたプライマー(5′-GACCCAGAATACCAAGT-3′及び5′-TTCTGCTGTGTCTTGGA-3′)を用いてPCR法により鶏Fas遺伝子の増幅を試みた。その結果、サイズの異なる3種類の特異的バンド(約700〜300塩基対)が得られ、これらをpGEM-Tベクターに組み込んだ。今後、これらの塩基配列を決定するとともに、これらのクローンをプローブとしてFas遺伝子の完全長を含むcDNAクローンをライブラリーよりスクリーニングする予定である。さらにゲノムを用いたPCR法によるクローニングも行っている。