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ウマヘルペスウイルス1型のウイルス再構築による病原性遺伝子の解析

马疱疹病毒1型病毒重建致病基因分析

基本信息

批准号：
06760265
负责人：
桐澤力雄
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Rakuno Gakuen University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ウマヘルペスウイルス1型の病原性に関与する遺伝子の解明を目的として、ウイルスDNA全体をカバーするDNA断片を混合して感染性ウイルスの再構築を試み、以下の成績を得た。1.強毒HH1株とこの株を弱毒化したBK343株のウイルスDNAの約40kbの部分消化断片をコスミドベクターpWE-15にクローニングし、それぞれのウイルスDNAを5種のDNA断片でカバーできるウイルス再構築ライブラリーを得た。クローン化した断片を通常の制限酵素切断で完全長のまま得るのは、断片内に切断点があるため不可能であった。そこで、クローン化したDNA内に切断点を持たないPacIあるいはPmeIで抽出できるよう、これらの酵素に対応するリンカーをクローン化したDNAに付加してpWE-15に再クローニングした。クローニングしたDNAはPacIあるいはPmeIで切断後、塩化セシウム密度勾配遠心により精製した。2.培養細胞へのDNA導入効率をリン酸カルシウム法、リポゾーム法およびエレクトロポレーション法を用いて検討した。培養細胞はウマ皮膚株化(E.Derm)細胞を用いた。これらの方法の細胞毒性を調べたところ、リン酸カルシウム法およびリポゾーム法はE.Derm細胞に対して著しい毒性を示した。エレクトロポレーションではBTX社のManipulator 600を用いて種々の電圧条件で調べたところ、100vの電圧下で約60%の細胞が生存し、これを超えると急激に細胞が死滅した。100vの電圧下で、βガラクトシダーゼを発現するpCH110プラスミドを導入したところ高い発現がみられた。同様の条件でHH1株およびBK343株の精製した5種のDNA断片をそれぞれ混合して導入したところ、再構築ウイルスが得られた。現在、強毒株のDNA断片を弱毒株のものと置き換えた変異ウイルスの再構築を試みている。

The pathogenicity of the virus is related to the identification of DNA fragments. The following results were obtained. 1. A 40kb fragment of DNA from strain HH1 and strain BK343 was obtained from 5 DNA fragments. The normal restriction enzyme is cut off completely, and the cut point in the fragment is impossible. The DNA cleavage site is located in the center of the cell, and the DNA cleavage site is located in the center of the cell. After cutting off, the density of DNA is adjusted to the distance. 2. DNA transfer efficiency in cultured cells was investigated by the following methods: acid transfer method, complex transfer method and complex transfer method. Cultured cells are used in E.Derm. This method modulates the cytotoxicity of E.Derm cells. About 60% of the cells survived when the voltage was adjusted to 100 V, and about 60% of the cells died when the voltage was adjusted to 100 V. At a voltage of 100v, the pCH110 plug connector can be introduced without the need for a beta converter. Under the same conditions, HH1 strain and BK343 strain were purified and 5 DNA fragments were introduced into the mixture and reconstructed. Now, the DNA fragments of virulent strains are replaced by attenuated strains.