表皮細胞のアポトーシスにおけるp53遺伝子およびp53蛋白の発現

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本年度、本研究代表者は、培養ヒト表皮細胞より、アポトーシスに密接に関与する酵素であるトランスグルタミナーゼのcDNAを、アポトーシスを媒介する膜表面蛋白であるFas抗原cDNAを、それぞれクローニングし、Biochem.Biophys.Res.Commun.に報告した。さらに表皮細胞のアポトーシスにおけるp53遺伝子、p53蛋白の発現について解析するために、培養ヒト表皮細胞に、ヒト細胞のDNA損傷を誘起することが知られている、各種波長の紫外線をさまざまの照射量で照射し、照射後経時的にそれぞれの表皮細胞より核酸蛋白同時抽出試薬ISOGEN-LSを用いてDNA、RNA、蛋白を抽出した。さらに今回抽出したDNAをアガロースゲルを用いて電気泳動しアポトーシスの指標であるDNA radder patternを今後検出する予定である。またRNAはホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動に供したのち、アイソトープで標識したp53 cDNAをプローブとしてハイブリダイゼーションを行い、バイオイメージングアナライザーBAS2000を用いてp53 mRNAの発現量を解析したい。今後、同様の方法で、アポトーシスを誘発する抗原で、我々が表皮細胞よりクローニングしたトランスグルタミナーゼcDNAおよびFas抗原cDNAをプローブとして用い、それぞれのmRNAの発現量を検討する。また今回抽出した蛋白を用いてSDS-ポリアクリルアミド電気泳動後、ウエスタンブロットを行い、抗p53抗体とペルオキシダーゼ結合二次抗体を用いてp53蛋白の発現量を今後ひきつづき検討する予定である。