シナプス長期増強特異的に発現が誘導される遺伝子の解析

突触长时程增强中特异性诱导表达的基因分析

• 批准号: 06858072
• 负责人: 植田 淳子
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06858072/
• 关键词: ホールセルクランプ法; シナプス伝達; 長期増強; 分子生物学; サブトラクション法; 差分発現法

昨年度までに、大脳神経解離培養系を確立し、この系において、in vivoと同様なシナプスが形成されること、さらには、Mg_<2+>除去操作により、長期増強(LTP)と同様な現象がおこることを確認している。本研究は、Mg_<2+>除去操作の前後で発現量の変化した遺伝子を解析する事を目的としているが、本年度はその準備段階として以下の実験事実を明らかにした。Mg_<2+>除去によるLTPが、転写阻害剤(actinomysin D)と蛋白質合成阻害剤(cycloheximide)によって抑制された。すなわち、この現象は核での新規mRNAの合成並びにそれに続く蛋白質合成のどちらの過去も必要とすることがわかった。Mg_<2+>除去によってLTPを誘導した後、このMg_<2+>-Free記録外液を採取し、MgCl_2を加えてMg_<2+>-Free conditioning medium(MFC)とした。このMFCを別の培養細胞に加えた所、LTPが誘導され、MFC中にLTPを誘発する因子が存在する可能性を示唆した。この様に、この系におけるLTP誘発には、特異的遺伝子の発現が必須であることが明白になった。従来、ある状態の細胞でのみ特異的に発現している遺伝子には、subtractive cDNA libraryを作成し、differential hybridizationを行うのが通常であった。しかし、この方法は高度の技術を必要とするにもかかわらず、再現性に乏しいと言う短所をもつ。これに反し、近年開発されたdifferential Display法は、それほど高度な技術を必要とせず、しかもコピー数の少ないものも、直接的に再現性よく比較できると言う利点をもつ。本研究でも後者の方法を適用すべく、まず培養細胞からのRNA精製法(AGPC法)を確立し、現在RT-PCRにおける増幅条件の検討を行っている。本方法は短時間で多くのクローンを解析でき、LTP関連遺伝子の同定が早期に実現できるものと期待される。

In the past year, a large number of neurodissociation culture systems have been established, and this system has been confirmed in vivo and in vivo. This study aims to analyze the changes in Mg <2+> before and after operation, and to clarify the preparation stage of this year. Mg_(2+)-free LTP, actinomysin D and cycloheximide This phenomenon is related to mRNA synthesis and protein synthesis. After Mg <2+> removal, Mg <2 +>-Free recording medium(MFC) was added. The possibility of LTP inducing factors in MFC culture was demonstrated. The LTP is the most important element in the system. The expression and differentiation of DNA in cells of different states are usually described as differential hybridization. The method is highly technical, and reproducibility is lacking. In recent years, differential Display methods have been developed, such as high technology, low cost, direct reproducibility, etc. In this study, the latter method was applied to establish the RNA purification method (AGPC method) for cell culture and to discuss the amplification conditions for RT-PCR. This method is based on the analysis of LTP related genes in a short time and the early realization of LTP related genes.