グルタミン酸受容体とカルシウム結合蛋白の発現相関とシナプス活動における機能的意義

谷氨酸受体和钙结合蛋白之间的表达关系及其在突触活动中的功能意义

基本信息

批准号：
10156241
负责人：
岡戸晴生
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Institute for Neuroscience
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

(1) グルタミン酸受容体発現とカルシウム結合蛋白発現の発現相関ラット大脳皮質初代培養神経細胞への神経栄養因子の添加による、グルタミン酸受容体発現とカルシウム結合蛋白発現の変動を解析した。その結果、BDNF添加により、GluR1,2/3の蛋白発現が増加すること、GuR2に対するGluRl,3の量が増加することを、ウエスタンブロット解析により見い出した。このことは、AMPA受容体の、特にカルシウム透過性のタイプの発現が増加したことを示唆している。そこで、AMPA刺激によるAMPA受容体チャネルを介する細胞内のカルシウム上昇を調べた。この際、ブロッカーによって、膜電位依存性カルシウムチャネル、NMDAチャネルを介したカウシウム流入は阻害している。その結果、BDNF処理によって、カルシウム上昇の強い細胞の割合が増加していることを明らかにした。また、BDNF処理によって、calbindinD28K陽性細胞が増加し、かつウエスタンブロットによっても蛋白の増加が検出された。以上の事は、カルシウム透過型AMPA受容体とcalbindinD28Kが機能的に相関していることを示唆している。(2) グルタミン酸受容体とカルシウム結合蛋白の発現相関の、LTPを含むシナプス伝達機構における機能的意義の解明外来遺伝子を過剰発現させることで、in vivoにおける機能を明らかにすることを目指している。これまでアデノウイルスベクターを用いる方法を検討し、小脳皮質注入により、橋核ニューロンに逆行性に効率よく外来遺伝子を導入する系を確立している。そこで、calbindinD28K発現アデノウイルス、カルシウム透過型変異体GluR2Q発現アデノウイルスを作製した。後者が後シナプスレベルで機能し、シナプス伝達をカルシウム透過型に変容できることは、須藤らによって明らかにされた。

（1）分析了谷氨酸受体表达与钙结合蛋白表达之间的表达相关性。分析了在大鼠大鼠脑皮质中添加神经营养因子在原代培养的神经元中，谷氨酸受体表达和钙结合蛋白表达的变化得到了分析。结果，Western印迹分析表明，添加BDNF增加了Glur1,2/3的蛋白质表达，而Glurl的量相对于GUR2增加了3。这表明AMPA受体的表达增加，尤其是钙通透性类型。因此，我们通过AMPA刺激引起的AMPA受体通道研究了细胞中钙的升高。此时，阻滞剂通过膜电压依赖性钙通道和NMDA通道抑制了库库的流入。结果，发现由于BDNF处理，具有强钙升高的细胞比例增加。此外，BDNF处理增加了CalbindInd28K阳性细胞的数量，并且Western印迹也检测到蛋白质的增加。以上表明钙可渗透的AMPA受体和Calbindind28K在功能上相关。（2）在包括LTP在内的突触传递机制中，谷氨酸受体和钙结合蛋白之间表达相关的功能意义阐明。我们的目标是通过过表达外国基因来阐明体内功能。到目前为止，已经研究了使用腺病毒载体的方法，并已经建立了一个系统，该系统有效地将外源基因逆行地引入了通过小脑皮层注射，将外源基因逆行且有效地引入了ponsive核神经元。因此，制备了表达CalbIndInd28K的腺病毒和钙渗透突变体表达腺病毒。它由Sudo等人揭示。后者在突触后水平上的功能可以将突触传播转化为可渗透的形式。