ColE2プラスミドの複製開始複合体の構造と機能

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ColE2プラスミドの複製系では,必須複製開始タンパク質(Rep)が複製開始部位(Ori)に特異的に結合してプライマーRNAを合成し,宿主大腸菌のDNA合成酵素Iがこれを利用してDNA合成を開始する.複製開始時にはRep-Ori-primer RNA-DNA合成酵素Iの複合体が形成されている可能性が考えられる.RepのC末端側約3分の1のペプチド(RepC117)も二量体を形成し,Repよりかなり弱いもののOriに特異的に結合する.Ori内には,複数の構造上あるいは機能上の部分領域が存在することが示唆されている.本年度の研究では,(Oriの構造,機能領域の解析)欠失および置換変異の解析よりOriが少なくとも3領域に分けられることを示した.Rep結合活性の低下した変異Oriの中にコピー数が上昇するものが見い出され,Repによる複製開始の負の調節の可能性が示唆された.(RepC117に特異的に結合する配列の詳細な解析)Hisタグを付けたRepC117をニッケルレジンに結合させたカラムとPCR法を用いて,ランダムな塩基配列をもつオリゴヌクレオチドからOri部位の左半分の領域に当たる共通配列を見い出した.この領域の大きさから判断するとRepC117中には複数のDNA結合ドメインが存在すると考えられる.(ColE2群プラスミドのRepと相同性を示す二つの複製開始タンパク質(Rep)をもつThiobacillus由来のpT32.1の複製開始機構の解析(SpainのDr.J.PereraおよびT.Aparicioとの共同研究))二つのRepの量産,精製を行った.複製開始タンパク質がプライメースであるプラスミドが広くグラム陰性菌から陽性菌にわたって存在していることを示している.