ColE2プラスミドの複製開始複合体の構造と機能

ColE2 质粒复制起始复合物的结构和功能

• 批准号: 10162204
• 负责人: 伊藤 建夫
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Shinshu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10162204/
• 关键词: ColE2プラスミド; 複製開始蛋白; 複製開始部位; DNA結合蛋白; プライマーRNA; コピー数; DNA結合ドメイン

ColE2プラスミドの複製系では,必須複製開始タンパク質(Rep)が複製開始部位(Ori)に特異的に結合してプライマーRNAを合成し,宿主大腸菌のDNA合成酵素Iがこれを利用してDNA合成を開始する.複製開始時にはRep-Ori-primer RNA-DNA合成酵素Iの複合体が形成されている可能性が考えられる.RepのC末端側約3分の1のペプチド(RepC117)も二量体を形成し,Repよりかなり弱いもののOriに特異的に結合する.Ori内には,複数の構造上あるいは機能上の部分領域が存在することが示唆されている.本年度の研究では,(Oriの構造,機能領域の解析)欠失および置換変異の解析よりOriが少なくとも3領域に分けられることを示した.Rep結合活性の低下した変異Oriの中にコピー数が上昇するものが見い出され,Repによる複製開始の負の調節の可能性が示唆された.(RepC117に特異的に結合する配列の詳細な解析)Hisタグを付けたRepC117をニッケルレジンに結合させたカラムとPCR法を用いて,ランダムな塩基配列をもつオリゴヌクレオチドからOri部位の左半分の領域に当たる共通配列を見い出した.この領域の大きさから判断するとRepC117中には複数のDNA結合ドメインが存在すると考えられる.(ColE2群プラスミドのRepと相同性を示す二つの複製開始タンパク質(Rep)をもつThiobacillus由来のpT32.1の複製開始機構の解析(SpainのDr.J.PereraおよびT.Aparicioとの共同研究))二つのRepの量産,精製を行った.複製開始タンパク質がプライメースであるプラスミドが広くグラム陰性菌から陽性菌にわたって存在していることを示している.

ColE2 プ ラ ス ミ ド の replication system で は, must begin copying タ ン パ ク mass (Rep) が duplicate parts (Ori) に specific に し て プ ラ イ マ し を ー RNA synthesis, host coliform の DNA synthesis enzyme I が こ れ を using し て DNA synthesis を began す る. At the beginning of replication, に に Rep-Ori-primer RNA - DNA synthesis enzyme I の complex が form さ れ て い る possibility が exam え ら れ る. Rep の の 1 C terminal side about 3 points の ペ プ チ ド (RepC117) も quantity body を し formation, Rep よ り か な り weak い も の の Ori に specific に combining す る. Within the Ori に は, the structure of the plural の あ る い は の part on function The field が has する とが とが implication されて る る. This year の research で は, Ori の structure, functional areas の parsing) lost owe お よ び replacement - different analytical よ の り Ori が less な く と も 3 areas に け ら れ る こ と を shown し た. Rep combined with low activity の し た - different Ori の in に コ ピ ー rising number が す る も の が see い out さ れ, Rep に よ る duplicate の negative の の possible adjustment Sexual が in stopping さ れ た. (RepC117 に specific に combining す る match column の な analysis) in detail His タ グ を pay け た RepC117 を ニ ッ ケ ル レ ジ ン に combining さ せ た カ ラ ム を と PCR method with い て, ラ ン ダ ム な salt base with column を も つ オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド か ら の Ori parts left points に の field when た る common column を see い out し た. こ の field の big き さ か ら judgment す る と RepC117 in に は plural の dna-binding ド メ イ ン が exist す る と exam え ら れ る. (ColE2 group プ ラ ス ミ ド の Rep と identity を す indicated two つ の duplicate タ ン パ ク mass (Rep) を も つ Thiobacillus origin の pT32.1 の duplicate institutions の parsing (- の Dr. J. erera お よ び T.A paricio と の joint research)) 2 つ の Rep の production, refined を line っ た. Duplicate タ ン パ ク qualitative が プ ラ イ メ ー ス で あ る プ ラ ス ミ ド が hiroo く グ ラ ム negative か ら positive に わ た っ て exist し て い る こ と を shown し て い る.