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ColE2プラスミドの複製開始後複合体の構造と機能

ColE2 质粒复制后起始复合物的结构和功能

基本信息

批准号：
09266205
负责人：
伊藤建夫
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Shinshu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ColE2プラスミドのDNA複製系では,複製開始にかかわるほとんどの機能がRep蛋白質に担われており,複製開始装置はRep蛋白質とDNA合成酵素Iを含むのみである.しかし,primer RNAは僅かに3残基であるので,複製開始時にはRep蛋白質-Ori部位-primer RNA-DNA合成酵素Iの複合体が形成される可能性が考えられる.Rep蛋白質のC末端側約2分の1のペプチド(RepC)は二重体を形成し,Ori部位に特異的に結合することができる.本年度の研究成果:1)Ori部位の内部機能構造(特異的結合配列,特異的結合促進配列,primer RNAの鋳型配列,必須複製開始配列)の確証のため,Ori部位の全域にわたり野性型とは異なる3種の塩基置換を導入し,得られた変異Ori部位について,in vivoのRep蛋白質結合能,DNA複製能を調べた.その結果,変異の位置によってRep蛋白質結合能とDNA複製能に及ぼす影響の程度に大きな違いがある3つの領域が存在することが明らかとなった.これらの内,右端3分の1の領域の変異では,結合にほとんど影響がないにもかかわらず,複製に対してはその活性が検出できないような大きな影響がある.この領域はRep蛋白質の結合以後の反応(primer RNA合成,DNA合成)に関与していると考えられる.DNA合成酵素Iが塩基配列特異的に結合することが知られている大腸菌染色体上のPU繰返し配列と相同な10bp余りの配列がOri部位中に2ヶ所見い出された.2)6ヶのHisを付けたRepC(RepC-6xHis)を量産し,これをニッケルレジンに結合させたカラムとPCR法を用いて,ランダムな塩基配列を持つオリゴヌクレオチドからRepCに特異的に結合するものを選択,増幅した.8サイクルの操作後に多数のオリゴヌクレオチドの塩基配列を決定し,RepCの結合の共通配列を求めた.

ColE2 is a DNA replication system that functions as a Rep protein, a replication initiation device that functions as a Rep protein and DNA synthase I. The possibility of forming Rep protein-Ori site-primer RNA-DNA synthetase I complex at the start of replication is examined. The RepC duplex is formed at about 2 residues from the C-terminal side of Rep protein, and Ori site-specific binding occurs. The results of this year's research:1) The internal functional structure of Ori site (specific binding alignment, specific binding promotion alignment,primer RNA type alignment, replication start alignment) was confirmed, and the whole domain of Ori site was introduced into wild type and different Ori site, and the protein binding energy and DNA replication energy were modulated in vivo. As a result, Rep protein binding energy, DNA replication energy, and the extent of its influence vary from location to location. In this case, the right 3 minutes and 1 of the field are different, and the combination of the two effects is different, and the reproduction is different. Rep protein binding in the field (primer RNA synthesis,DNA synthesis) Related to DNA Synthetase I Binding to DNA Base Alignment Specific DNA Base Sequence Specific DNA Base Alignment Specific (RepC-6xHis) is mass-produced, and the combination of RepC-6xHis and RepC-6xHis is determined by PCR. The base alignment of RepC-6xHis is determined by PCR. The base alignment of RepC-6xHis is determined by PCR. The base alignment of RepC-6xHis is determined by PCR.