ColE2プラスミドの複製開始複合体の構造と機能

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ColE2プラスミドの複製開始反応は、プラスミド自身にコードされたRep蛋白質と宿主大腸菌のDNA合成酵素Iのみでおこる。ColE2Rep蛋白質は塩基配列特異的プライマーRNA合成活性を示す。プライマーRNAは僅かに3残基であるので、複製開始時にはRep蛋白質-Ori部位-プライマーRNA-DNA合成酵素Iの複合体が形成される可能性も考えられる。本年度の研究成果:1,HisタグをC末端に付けることにより活性のあるRep蛋白質およびRep蛋白質のC末端側半分の領域に当たるものを容易に部分精製できるようになった。2,Rep蛋白質およびRep蛋白質のC末端側半分のペプチドは、いずれも高塩濃度溶液中でも安定な二量体を形成している。3,上記のHisタグをC末端に付けたRep蛋白を用いて、ゲルシフト法によりRep蛋白質とOri部位との特異的結合を検出出来るようになった。これによりRep蛋白質のC末端側半分のペプチドが、Rep蛋白質よりはかなり弱いもののOri部位に特異的に結合することが示された。4,ゲルシフトとフットプリント解析の結果からRep蛋白質のC末端側半分のペプチドは、その濃度に応じて大きさの異なる2種の複合体を形成する。Rep蛋白質はOri部位内の7bpの直列配列に対応して直列的な四量体(あるいはそれ以上の多量体)を形成して結合していることが考えられる。5,Ori部位内に存在する7bpの直列繰り返し配列について、いずれか一方を欠くか、あるいはそっくり他の塩基配列に置き換えたものでは、Re蛋白質結合能がほとんど失われた。これらの7bpの直列繰り返し配列中にはRep蛋白質による認識、結合に重要な役割をもつ残基が含まれていると考えられる。