プラスミド複製開始蛋白mRNAの動的機能構造とアンチセンスRNAによる発現制御

標的RNA(センスRNA)上の相補的な塩基配列に結合し、その機能発現を阻害するアンチセンスRNAの機能は、RNAの高次構造とその変化をともなうRNAの動的機能の一つに数えられよう.ColE2群プラスミドDNA複製系では,必須複製開始蛋白質(Rep)の発現が,そのmRNAに対するアンチセンスRNA(RNAI)により,転写後の段階で調節されている.本年度の成果:1)Rep蛋白質の翻訳開始に関与する上流配列と下流配列を同定するため,開始コドンの上流と下流の領域に新しい欠失変異や部位指定の塩基置換を導入することを試みたが,プラスミドの回収が極端に悪く,さらに予期せね挿入,欠失をもつものばかりで目的の変異を得ることができなかった.この領域が複雑な2次〜高次構造を形成するRNAをコードするためと考えられ,このようなDNA領域に簡便変異を導入する条件を確立すること重要である.2)ColE8においてrep-RNAI領域の遺伝子量を変化させた時のRep蛋白質発現量が遺伝子量に比例しており,RNAIによる調節の機能がcisの構造でも低下していること,Rep蛋白質mRNAとRNAIとの結合は正常に起こることが明らかとなった.このプラスミドにおいてRNAIによる調節に欠陥のある段階をかなり絞り込むことができた.3)Rep蛋白質の発現,RNAIの阻害活性に影響を与える宿主大腸菌因子の検索を試みた.他の系でアンチセンスRNAの作用に直接,間接の関与が証明あるいは推定されているRNaseE,ポリA合成(付加)酵素,ポリヌクレオチドホスホリラーゼの遺伝子に変異をもつ大腸菌へのColE2プラスミドの形質転換効率は野性型に比べてかなり低いが,保持菌中でのプラスミドDNA複製には特に異常は見られなかった.現在,プラスミドコピー数,Rep蛋白質発現量,Rep蛋白質mRNAとRNAIのレベルを調べている.

標的RNA(センスRNA)上の相補的な塩基配列に結合し、その機能発現を阻害するアンチセンスRNAの機能は、RNAの高次構造とその変化をともなうRNAの動的機能の一つに数えられよう.ColE2群プラスミドDNA複製系では,必須複製開始蛋白質(Rep)の発現が,そのmRNAに対するアンチセンスRNA(RNAI)により,転写後の段階で調節されている.本年度の成果:1)Rep蛋白質の翻訳開始に関与する上流配列と下流配列を同定するため,開始コドンの上流と下流の領域に新しい欠失変異や部位指定の塩基置換を導入することを試みたが,プラスミドの回収が極端に悪く,さらに予期せね挿入,欠失をもつものばかりで目的の変異を得ることができなかった.この領域が複雑な2次〜高次構造を形成するRNAをコードするためと考えられ,このようなDNA領域に簡便変異を導入する条件を確立すること重要である.2)ColE8においてrep-RNAI領域の遺伝子量を変化させた時のRep蛋白質発現量が遺伝子量に比例しており,RNAIによる調節の機能がcisの構造でも低下していること,Rep蛋白質mRNAとRNAIとの結合は正常に起こることが明らかとなった.このプラスミドにおいてRNAIによる調節に欠陥のある段階をかなり絞り込むことができた.3)Rep蛋白質の発現,RNAIの阻害活性に影響を与える宿主大腸菌因子の検索を試みた.他の系でアンチセンスRNAの作用に直接,間接の関与が証明あるいは推定されているRNaseE,ポリA合成(付加)酵素,ポリヌクレオチドホスホリラーゼの遺伝子に変異をもつ大腸菌へのColE2プラスミドの形質転換効率は野性型に比べてかなり低いが,保持菌中でのプラスミドDNA複製には特に異常は見られなかった.現在,プラスミドコピー数,Rep蛋白質発現量,Rep蛋白質mRNAとRNAIのレベルを調べている.