水晶体の透明性維持におけるリン酸化-脱リン酸化調節機構の関与-ホスホチロシンホスファターゼ活性を中心とする検討-

磷酸化-去磷酸化调节机制参与维持晶状体透明度 - 以磷酸酪氨酸磷酸酶活性为中心的研究 -

基本信息

批准号：
10877276
负责人：
梅田泉
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Teikyo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は鶏胚水晶体中のある種の酸性ホスファターゼがホスホチロシルプロテインホスファターゼ(PTPase)活性を持つことを以前に見い出した。この酵素が水晶体の細胞分化、細胞接着あるいはアポトーシス等の制御を介して水晶体の透明性を制御している可能性を想定し、本研究を進めた。1. 鶏胚水晶体中のPTPPaseの分離精製微量で不安定な酵素であるため、短時間でステップの少ない精製方法を検討した。分取用高性能ゲル濾過カラムと容量1mLの高性能陽イオン交換カラムで精製を行い、さらにSDS電気泳動を行うことより、ほぼ単一の蛋白質にまで精製することができた。2段階のカラム精製で比活性は520倍に上昇し、活性回収率は8.1%であった。2. 生化学的性質等の検討この酵素の分子量は約18kDaであり、ホスホチロシンやFMNに対する基質特異性が高く、バナジン酸やSH阻害剤、PAOにより強い活性阻害を受けた。ペプチドや蛋白質のチロシン残基に結合するリン酸基を特異的に加水分解することも確認できた。これらの性質は、最近性質が明らかにされつつある低分子型PTPPaseに類似し、この範疇に属するものと思われる。3. 他組織、他動物での検討鶏胚水晶体の酸性ホスファターゼ活性の大半はこの酵素であることを明らかにした。それに比べ、高い酸性ホスファターゼ活性を有する肝臓や脳では、この酵素が占める比率はわずかであった。また鶏胚のみでなくウシ、ウサギおよびマウス水晶体中にもこの酵素の存在を確認した。4. アミノ酸一次構造解析精製標品を用いて部分一次構造の決定を試みたが、N末端がブロックされており、現時点では成功していない。今後デブロッキング等を行って再試行の予定である。5. 機能解析現時点ではこの酵素の水晶体での機能の解析には至らなかったが、この酵素に対するモノクローナル抗体を現在作成中であり、機能解析の大きな武器になるものと期待している。

我们先前发现，鸡胚胎晶状体中的某些酸性磷酸酶具有磷酸酪蛋白蛋白磷酸酶（PTPase）活性。这项研究是根据该酶通过控制细胞分化，细胞粘附或凋亡来调节镜头透明度的可能性进行的。 1。鸡胚胎晶状体中PTPPase的分离和纯化，因为它是少量的不稳定酶，这是一种纯化方法，一种纯化的方法，研究了短，低步骤的过程。在高性能的制备凝胶过滤柱上进行纯化，并具有1 ml体积的高性能阳离子交换柱，然后进行SDS电泳，从而使几乎单个蛋白质纯化成为可能。特定活性通过两步柱纯化增加了520次，活动回收率为8.1％。 2。对生物化学性质等的研究。该酶的分子量约为18 kDa，对磷酸酪氨酸和FMN具有较高的底物特异性，并且受到钒酸，SH抑制剂和PAO的强烈抑制。还证实了与肽和蛋白质酪氨酸残基结合的磷酸组和蛋白质的特异性水解。这些特性类似于低分子量PTPPase，其特性最近被揭示，并且很可能属于该类别。 3。在其他组织和动物中的研究表明，这种酶是鸡胚胎晶状体中的大多数酸性磷酸酶活性。相比之下，该酶仅占酸性磷酸酶活性高的肝脏和大脑的一小部分。该酶的存在不仅在鸡胚胎中，而且在牛，兔子和小鼠镜头中得到证实。 4。氨基酸初级结构分析试图使用纯化的制剂来确定部分初级结构，但是N-末端被阻塞，目前尚未成功。我们计划将来通过进行封锁和其他事情来再次尝试。 5。目前，功能分析，我们尚未能够分析该酶在镜头中的功能，但是我们目前正在为该酶创建单克隆抗体，我们希望它将成为功能分析中的主要武器。