ローカリゼーションシグナルトラップ法の開発と、細胞分化に関する遺伝子群の解析

目的蛋白質とEGFPの融合蛋白質が本来の細胞内局在と同じかどうかを調べる基礎検討を行うために、細胞周期依存的に細胞質から核内に移行する Haspin と EGFP の融合蛋白質を培養細胞に発現させてその動向を観察した。その結果、融合蛋白質も Haspin と同様に細胞周期に依存して細胞質と核内を行き来することを確認した。さらにその様子は細胞を生かしたまま経時的に観察することが可能であった。上記実験とは別に、精子先体(分泌小胞)内に存在するアクロシンのシグナルペプチドをつないだEGFPを発現するトランスジェニックマウスを作製したところ、予想通り、EGFPが精子の先体内腔に局在した。またその精子を用いることにより、受精に必須の過程である先体反応の間に先体内腔からEGFPが放出される様子を経時的に観察することができた。以上の点から、EGFPとの融合蛋白質が目的蛋白質と同様の局在を示すことを確認し、論文報告した。今年度は、精巣で発現する遺伝子のcDNAライブラリーを構築したが、そのベクターにEGFP遺伝子を組み込んで精巣蛋白質とEGFPの融合蛋白質を発現する発現ライブラリーの作製には至っていない。今後も実験を続け、ライブラリー完成後は精巣由来細胞株であるF9に導入してEFGPの蛍光をもとにスクリーニングを開始する予定である。

目的蛋白質とEGFPの融合蛋白質が本来の細胞内局在と同じかどうかを調べる基礎検討を行うために、細胞周期依存的に細胞質から核内に移行する Haspin と EGFP の融合蛋白質を培養細胞に発現させてその動向を観察した。その結果、融合蛋白質も Haspin と同様に細胞周期に依存して細胞質と核内を行き来することを確認した。さらにその様子は細胞を生かしたまま経時的に観察することが可能であった。上記実験とは別に、精子先体(分泌小胞)内に存在するアクロシンのシグナルペプチドをつないだEGFPを発現するトランスジェニックマウスを作製したところ、予想通り、EGFPが精子の先体内腔に局在した。またその精子を用いることにより、受精に必須の過程である先体反応の間に先体内腔からEGFPが放出される様子を経時的に観察することができた。以上の点から、EGFPとの融合蛋白質が目的蛋白質と同様の局在を示すことを確認し、論文報告した。今年度は、精巣で発現する遺伝子のcDNAライブラリーを構築したが、そのベクターにEGFP遺伝子を組み込んで精巣蛋白質とEGFPの融合蛋白質を発現する発現ライブラリーの作製には至っていない。今後も実験を続け、ライブラリー完成後は精巣由来細胞株であるF9に導入してEFGPの蛍光をもとにスクリーニングを開始する予定である。