極限微生物に由来する多糖分解酵素の構造―活性相関と糖鎖認識機構

极端微生物多糖降解酶的构效关系及糖链识别机制

• 批准号: 11121211
• 负责人: 中村 聡
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11121211/
• 关键词: キシラナーゼ; タンパク質工学; 進化分子工学; 触媒ドメイン; 反応至適pH; キシラン結合ドメイン; ファージディスプレイ; 糖鎖認識

好アルカリ性バシラス属細菌41M-1株キシラナーゼは触媒ドメインとキシラン結合ドメイン(XBD)から構成される.41M-1株キシラナーゼの触媒ドメインについて,タンパク質工学的検討を行った.Asn44を酸性アミノ酸Aspに置換したところ,反応の至適がアルカリ性(pH9.0)からが中性(pH6.0)へとシフトすることがわかった.次に,進化分子工学によるXBDの機能変換を試みた.ファージベクターfNE2を用い,繊維状ファージの外殻タンパク質gIIIpのアミノ末端に相当する位置に41M-1株キシラナーゼ遺伝子XBD領域を連結した.この組換えファージDNAを導入した大腸菌より調製した組換えファージは不溶性キシランヘの高い結合能を有しており,XBDがファージ表面に正しくディスプレイされていることが示された.Error-prone PCRによりXBD遺伝子にランダム変異導入を行った.変異導入後のXBD遺伝子をfNE2に挿入した後,大腸菌に導入し,約20,000株の変異体を含むファージライブラリーを作製した.ファージライブラリー溶液を不溶性キシラン充てんカラムに通し,流出した画分を回収して大腸菌に再感染させた.感染後の大腸菌からファージ粒子を調製し,上の操作を繰り返すことにより,不溶性キシラン結合能が野生型XBDの1/1,000以下に低下した変異体10株を選抜した.得られた変異型XBD遺伝子の塩基配列解析により,XBD中のW317およびF284が不溶性キシランヘの結合に重要な役割を果たしていることが明らかとなった.

A strain 41M-1 of bacteria belonging to the genus Asn 44 was found to be active in both the catalytic and catalytic domains (XBD). Asn 44 was found to be active in both the acidic and the neutral domains (pH9.0). Next, evolutionary molecular engineering, XBD, and functional changes are being attempted. In the middle of the application, the shell of the three-dimensional shell is connected to the XBD field at the position corresponding to the end of the shell at 41M-1. The composition of DNA was introduced into E. coli, the modulation of DNA was performed, and the high binding energy of DNA was detected. XBD was introduced into E. coli by Error-prone PCR. About 20,000 strains of E. coli were introduced into the plant after the introduction of XBD gene. The solution is insoluble in water, and the effluent is re-infected with Escherichia coli. After infection, E. coli particles were modulated, and the insoluble protein binding energy was 1/1,000 lower than that of wild type XBD. Ten foreign strains were selected. XBD gene sequence analysis,XBD in W317 and F284 insoluble in the combination of important service cut results.

项目成果

S. Nakamura et al.: "A Novel Bacteriorhodopsin-like Protein from Haloarcula japonica Strain Tr-1 : Gene Cloning, Sequencing and Transcription Analysis"Extremophiles. (印刷中). (2000)

S. Nakamura 等人：“来自 Haloarcula japonica 菌株 Tr-1 的新型细菌视紫红质样蛋白：基因克隆、测序和转录分析”（出版中）。

S. Nakamura et al.: "Purification and Characterization of a Ferredoxin from Haloarcula japonica Strain TR-1"BioMetals. (印刷中). (2000)

S. Nakamura 等人：“来自 Haloarcula japonica Strain TR-1 的铁氧还蛋白的纯化和表征”BioMetals（出版中）。

S. Nakamura et al.: "Molecular Cloning of A1-ATPase Gene from Extremely Halophilic Archaeon Haloarcula japonica Strain TR-1"Necleic Acids Symp. Ser.. 42. 75-76 (1999)

S. Nakamura 等人：“来自极端嗜盐古菌 Haloarcula japonica 菌株 TR-1 的 A1-ATP 酶基因的分子克隆”Necleic Acids Symp。

S. Nakamura et al.: "Secretionl Expression of Bacillus subtilis Xylanase Gene in the Basidiomycete Coprinus cinereus"FEMS Microbiol. Lett.. 178. 277-282 (1999)

S. Nakamura 等人：“枯草芽孢杆菌木聚糖酶基因在担子菌灰盖鬼伞中的分泌表达”FEMS Microbiol。

S. Nakamura et al.: "Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation"Uni Publishers Co., Ltd.. 650 (1999)

S. Nakamura 等：《纤维素降解的遗传学、生物化学和生态学》Uni Publishers Co., Ltd.. 650 (1999)