細胞接着・細胞骨格の制御蛋白質ERMファミリーとWD40ドメインの構造化学的解析

细胞粘附/细胞骨架调节蛋白 ERM 家族和 WD40 结构域的结构化学分析

基本信息

批准号：
11160210
负责人：
武内恒成
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11160210/
关键词：
細胞接着蛋白質大量発現アクチン細胞骨格

项目摘要

1)新規神経特異的アクチン結合蛋白質ClipinCと神経系小胞輸送に関わるmgl-1の機能と、それらのWD40ドメインの分子機能とその構造解析。我々が単離したClipinCは、細胞性粘菌の移動、分裂、食作用に重要な機能を持つとされる細胞性粘菌アクチン結合分子Coloninの哺乳類ホモログで、細胞内において細胞-基質間接着部位に濃縮するとともに、軸索伸長にも機能した。また細胞接着裏打ち分子Vinculinと、さらには、低分子量G蛋白質Rac下流でNADPH oxidaseを制御するP40Phoxとも結合することを明らかとした。また、転写因子の抗体を用いたDNA-蛋白質複合体の免疫精製法を用いてHoxC8の標的分子mgl-1をマウスから同定した。このmgl-1は、ショウジョウバエ癌抑制遺伝子l(2)glのマウスホモログで、Syntaxin1結合分子として同定されたTomosynとファミリーを形成した。Mgl-1も細胞内小胞系と骨格系のリンカー蛋白質として機能する知見を得た。2)エズリン(ezrin)、ラディキシン(radixin)、モエシン(moesin)ファミリー蛋白質(以下ERM)の構造解析と、細胞内シグナル伝達における制御機構。ERMファミリー蛋白質は、N末端側半分に細胞膜結合部位、C末端側にアクチン結合部位をもち、細胞膜とアクチンフィラメント間のクロスリンカーとして、PIP2やRhoにより制御され機能する。EMRファミリーの分子内機能ドメインやその生理作用が示唆されているが、実際の三次元構造と機能の相関は明らかではない。そこで示唆されているHead-to-tailでの分子内構造変化によるドメインのマスキングや、リン酸化による分子結合の変化を見るために、ERMの種々の機能ドメイン変異体をバキュロ発現系で作製した。低角度回転蒸着法での電子顕微鏡による形態構造観察を開始し、本年度この形態観察の解析が進められるまでになった。3)構造解析及び生化学的蛋白質相互作用の解析のための、カイコ核多角体病ウイルス(BmNPV)を用いた高発現系の導入。本年度、ClopinC蛋白質で発現に成功し、4令幼虫1匹から1mgの蛋白を得ることが出来た。ClipinC蛋白質では可溶性分画に発現し、カイコ特有のメラニン化が見られ当初精製に難航したが、最近、メラニン化を防ぎ精製を進める系を確立することが出来た。カイコ数十匹を用いることで数十mgの蛋白を容易に得ることが出来ることを示せたとともに、ウイルスを細胞感染させた場合でもバキュロウイルス系より数倍の蛋白質を得ることに成功している。従来、広く進められているバキュロウイルス発現系を遥かに凌ぐ発現量を持つこのシステムでの生化学と構造解析の実績を作るとともに、汎用できる系としての確立を進めている。

1）MGL-1的功能参与了新型神经特异性肌动蛋白结合蛋白，夹紧和神经系统囊泡的运输，以及它们的分子功能和WD40域的结构分析。我们分离的夹子是细胞粘膜肌动蛋白结合分子结肠的哺乳动物同源物，据说在迁移，分裂和吞噬细胞增多症中具有重要功能。它在细胞内浓缩在细胞基底粘附部位，并在轴突延伸中起作用。还揭示了它与细胞粘附衬底分子质蛋白结合，也与P40phox结合，该p40phox调节低分子量G蛋白RAC下游的NADPH氧化酶。此外，使用转录因子的抗体，使用DNA-蛋白质复合物的免疫疗法方法从小鼠中鉴定出HOXC8的靶分子MGL-1。该MGL-1与tomosyn形成了一个家族，该家族被鉴定为果蝇肿瘤抑制基因L（2）GL的小鼠同源物中的语法结合分子。我们已经发现，MGL-1还充当细胞内囊泡和骨骼系统的接头蛋白。 2）在细胞内信号传导中，埃兹林，radixin和Moesin家族蛋白（ERM）的结构分析以及调节机制。 ERM家族蛋白在N末端一半中具有细胞膜结合位点，并且在C末端具有肌动蛋白结合位点，并且由PIP2和RHO调节的细胞膜和肌动蛋白丝之间的交联。尽管已经提出了EMR家族的分子内功能结构域及其生理效应，但实际的三维结构与功能之间的相关性尚不清楚。为了查看由于磷酸化而引起的分子内结构变化以及分子结合的变化，域掩盖的建议变化，使用baculo表达系统创建了ERM的各种功能域突变体。我们已经开始使用电子显微镜使用低角度旋转沉积法观察形态结构，对这种形态学观察的分析现已在今年进行。 3）使用蚕核多面病毒（BMNPV）引入高度表达的系统，以进行结构分析和生化蛋白质相互作用分析。今年，我们成功地使用蛋白质蛋白表达了蛋白质，我们能够从一个4个个体幼虫中获得1 mg的蛋白质。夹层蛋白在可溶性馏分中表达，观察到蚕的黑色素化，使其难以纯化，但最近可以建立一种阻止黑素化和纯化进展的系统。已经表明，几十粒蚕可以很容易地获得几十毫克的蛋白质，即使细胞感染了病毒，它也成功地获得了蛋白质的几倍，而不是杆菌病毒的蛋白质。我们正在创建该系统的生物化学和结构分析的记录，该系统的表达水平远远超过了广泛使用的杆状病毒表达系统，并且也正在努力将其确定为通用系统。