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細胞接着・細胞骨格の制御蛋白質ERMファミリーとWD40ドメインの構造化学的解析

细胞粘附/细胞骨架调节蛋白 ERM 家族和 WD40 结构域的结构化学分析

基本信息

批准号：
11160210
负责人：
武内恒成
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11160210/
关键词：
細胞接着蛋白質大量発現アクチン細胞骨格

项目摘要

1)新規神経特異的アクチン結合蛋白質ClipinCと神経系小胞輸送に関わるmgl-1の機能と、それらのWD40ドメインの分子機能とその構造解析。我々が単離したClipinCは、細胞性粘菌の移動、分裂、食作用に重要な機能を持つとされる細胞性粘菌アクチン結合分子Coloninの哺乳類ホモログで、細胞内において細胞-基質間接着部位に濃縮するとともに、軸索伸長にも機能した。また細胞接着裏打ち分子Vinculinと、さらには、低分子量G蛋白質Rac下流でNADPH oxidaseを制御するP40Phoxとも結合することを明らかとした。また、転写因子の抗体を用いたDNA-蛋白質複合体の免疫精製法を用いてHoxC8の標的分子mgl-1をマウスから同定した。このmgl-1は、ショウジョウバエ癌抑制遺伝子l(2)glのマウスホモログで、Syntaxin1結合分子として同定されたTomosynとファミリーを形成した。Mgl-1も細胞内小胞系と骨格系のリンカー蛋白質として機能する知見を得た。2)エズリン(ezrin)、ラディキシン(radixin)、モエシン(moesin)ファミリー蛋白質(以下ERM)の構造解析と、細胞内シグナル伝達における制御機構。ERMファミリー蛋白質は、N末端側半分に細胞膜結合部位、C末端側にアクチン結合部位をもち、細胞膜とアクチンフィラメント間のクロスリンカーとして、PIP2やRhoにより制御され機能する。EMRファミリーの分子内機能ドメインやその生理作用が示唆されているが、実際の三次元構造と機能の相関は明らかではない。そこで示唆されているHead-to-tailでの分子内構造変化によるドメインのマスキングや、リン酸化による分子結合の変化を見るために、ERMの種々の機能ドメイン変異体をバキュロ発現系で作製した。低角度回転蒸着法での電子顕微鏡による形態構造観察を開始し、本年度この形態観察の解析が進められるまでになった。3)構造解析及び生化学的蛋白質相互作用の解析のための、カイコ核多角体病ウイルス(BmNPV)を用いた高発現系の導入。本年度、ClopinC蛋白質で発現に成功し、4令幼虫1匹から1mgの蛋白を得ることが出来た。ClipinC蛋白質では可溶性分画に発現し、カイコ特有のメラニン化が見られ当初精製に難航したが、最近、メラニン化を防ぎ精製を進める系を確立することが出来た。カイコ数十匹を用いることで数十mgの蛋白を容易に得ることが出来ることを示せたとともに、ウイルスを細胞感染させた場合でもバキュロウイルス系より数倍の蛋白質を得ることに成功している。従来、広く進められているバキュロウイルス発現系を遥かに凌ぐ発現量を持つこのシステムでの生化学と構造解析の実績を作るとともに、汎用できる系としての確立を進めている。

1)The new neuro-specific protein ClipinC is related to the function of mgl-1, molecular function and structural analysis of WD40. Clipin C plays an important role in the migration, division and feeding of cellular mycetes. It also plays an important role in the concentration of intracellular cell-matrix junction and axonal elongation of mammalian mycetes. Cell adhesion molecule Vinculin, Rac, low molecular weight protein NADPH oxidase, P40Phox, Rac, Rac, Rac Immunological purification of DNA-protein complexes using HoxC8 target molecule mgl-1 Syntaxin-1 binding molecules are formed by the formation of a stable Tomosyn-1 protein. Mgl-1 is a small cellular system and a skeletal system, and its protein function is known. 2) Structural analysis of ezrin, radixin, moesin and ERM proteins, and control mechanisms for intracellular expression. ERM protein binding site, N-terminal half, C-terminal half, cell membrane binding site, PIP2 and Rho binding site control function The molecular function of EMR is related to the physiological function of EMR, and the three-dimensional structure and function of EMR are related to EMR. The molecular structure of ERM is changed from Head-to-tail to Acid-to-DNA. The morphological observation of electron microscope by low angle evaporation method began, and the analysis of morphological observation in this year was further improved. 3)Structural analysis and biochemical analysis of protein-protein interactions and introduction of high-level development systems for nuclear polyhedrosis (BmNPV) This year, ClopinC protein was successfully discovered, and 4 larvae were successfully discovered. ClipinC protein soluble analysis, development, purification, purification, purification. Tens of mg of protein were obtained from the cells. The development of the biochemistry and structural analysis of the development system has been carried out in a variety of ways, including the development of biochemistry and structural analysis.