細胞膜情報伝達分子群の蛋白質大量発現系の構築と1分子観察操作法による解析

细胞膜信号分子大规模蛋白表达系统的构建及单分子观察技术分析

基本信息

批准号：
13014209
负责人：
武内恒成
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13014209/
关键词：
細胞骨格蛋白質大量発現細胞接着

项目摘要

1)神経特異的アクチン結合蛋白質clipinCはWD40ドメインとC末側のαヘリックス構造からなる分子である。我々はこの分子の機能解析のために結合分子の検索を進め、NADPHオキシダーゼ活性化のアダプター分子の一つp40^<phox>が結合することをすでに見いだしている。今年度、この結合領域の検討を進め、p40^<phox>PCドメインがclipinCのWD40ドメインと結合することが明らかとなった。また、このp40^<phox>をはじめとするp47^<phox>・P67^<phox>を介してRacのシグナルがclipinCに伝わり、アクチン骨格制御に関わることを示した。さらに、p40^<phox>・p47^<phox>・p67^<phox>分子群が確かに神経系組織にも発現し、clipinCと共局在することを免疫組織化学等で見いだした。2)構造解析および蛋白質機能解析のため、バキュロウイルスを上回る大量蛋白質産生が可能なカイコ核多角体病ウイルス(BmNPV)を用いた発現系を導入している。我々は今までに8種類の蛋白質で発現に成功しているが、今年度、神経接着分子NCAMについて天然型だけでなく、糖鎖修飾領域を変異した分子の発現を行い、この系における昆虫型糖鎖修飾が哺乳類における糖鎖修飾といかに異なるかの解析を行った。さらに、いままで幼虫を用いた発現を進めてきたが、今年度から蛹(さなぎ)を用いても感染・発現が可能であることを見いだし、より簡易かつ蛋白質の精製の容易な系の確立を進めることが出来た。3)細胞接着分子NCAM, TAG-1、およびそのリガンドであるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンPhosphacan/Neurocanのカイコバキュロにより産生した蛋白質を用いた1分子観察操作法による解析を開始した。リガンド刺激をすることによって、免疫グロブリンスーパーファミリー接着分子群が会合すること、いかに情報を細胞内に伝えるかを解析する系を構築した。

1）神经毒素结合蛋白夹夹是由WD40结构域和C末端α-螺旋结构组成的分子。我们已经开始寻找结合分子以进行该分子的功能分析，并且已经发现p40^<phox>是NADPH氧化酶激活的衔接分子之一，结合了。今年，我们一直在研究这个结合区域，并且已经揭示了p40^<phox> PC结构域与Clipinc的WD40结构域结合。它还表明，RAC信号通过P47^<phox>和p67^<phox>（包括p40^<phox>）传输到夹具，并参与肌动蛋白骨骼对照。此外，通过免疫组织化学发现了p40^<phox>，p47^<phox>和p67^<phox>分子肯定在神经组织中表达并与夹具共定位。 2）为了结构和蛋白质功能分析，已经引入了使用蚕核多面病毒（BMNPV）的表达系统，该病毒（BMNPV）已被引入大量的蛋白质。到目前为止，我们已经成功地表达了8种类型的蛋白质，但是今年，我们不仅表达了神经粘附分子NCAM的自然形式，而且还表达了一种分子，该分子已突变糖基化区域，并分析了该系统中昆虫型糖基在该系统中与糖基化糖基化糖基中与糖基化糖基化的差异的不同。此外，尽管使用幼虫的表达一直在直到现在，但我们已经发现即使使用pupa（pupa）也可以实现感染和表达，从本财政年开始，我们已经能够建立一个更易于纯化蛋白质的系统。 3）我们使用单个分子观察方法开始分析细胞粘附分子NCAM，TAG-1及其配体硫酸软骨素硫酸软骨蛋白蛋白聚糖磷糖/Neurocan，这是蚕paculo产生的蛋白质。构建了一个系统来分析免疫球蛋白超家族粘附分子的关联，通过刺激配体以及细胞内的信息如何传播。