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神経回路形成における脳特異的プロテオグリカンの生理機能解析

脑特异性蛋白多糖在神经回路形成中的生理分析

基本信息

批准号：
00J04299
负责人：
山内忍
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

ニューログリカンC(NGC)は、中枢神経特異的な発現を示す膜貫通型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンである。昨年度までの研究で、脳の発達に伴い、NGCの一部が脂質ラフトに局在すること、また、NGCはNGCと共沈するプロテインキナーゼにより、コアタンパク細胞外領域のセリン残基がリン酸化されること、そして、そのリン酸化はカゼインキナーゼIIに似た性質を持つプロテインキナーゼによりなされることが明らかになった。プロテインキナーゼの中には細胞表面において作用するエクトプロテインキナーゼ活性の存在が確認されており、多くの細胞機能への関与が報告されている。そこで、本年度はNGCのリン酸化セリン残基の位置決定とエクトプロテインキナーゼによるNGCリン酸化の可能性について検討した。まず、生後21日齢ラット脳膜画分を用いたNGC抗体での免疫沈降に続くin vitroキナーゼ反応により[^<32>P]標識したNGCを臭化シアンで分解し、リン酸化ペプチドマッピングをおこなった。その結果、NGC細胞外領域の230番目のグリシンから259番目のロイシンまでの配列のセリン残基の中にNGCリン酸化部位が存在すると予想された。次に、ラット胎仔大脳皮質初代培養神経細胞を1mM Na_2HPO_4の存在下で[γ-^<32>P]ATPとインキュベートした結果、NGCが^32P標識された。この標識は、培養液中に1mM非標識ATPを添加することで完全に阻害された。この結果は、NGCが細胞表面においてエクトプロテインキナーゼによってリン酸化されることを示す。一方、細胞に[^<32>P]正リン酸を取り込ませた時、^<32>P標識されたNGCは1mM非標識ATP存在下(エクトプロテインキナーゼによるNGCの^<32>P標識を完全に阻害する濃度)でさえも検出された。以上の結果は、NGCが細胞質内、および細胞表面の両方においてリン酸化されうることを示している。

C (NGC), the central god's special device shows that the membrane is normal, sulfuric acid, sulfuric acid, sulfur In the last year, the research, the research and the development of NGC have been carried out in the study of the extracellular domain, the extracellular domain, and the acidification of the residues in the extracellular domain of the plant, which was co-deposited by the NGC and the NGC of the whole body. The acidizing effect is similar to that of II, which is similar to that of others. In the system, the cell surface is active, the cell surface is sensitive, the cell is active, the cell is sensitive, and the report is active. The position of the residue is determined by the possibility of acidizing, the possibility of acidification, the possibility of acidizing. After birth, 21 days after birth, the membrane painting was marked with NGC antibody, immune deposition, in vitro antibody, anti-lt;32>P, anti-NGC, deodorization, acidification, acidification. The results showed that there was a predisposing enzyme in the acidified site of NGC in the extracellular domain of NGC. The results of the [γ-^ & lt;32>P] ATPase 1mM Na_2HPO_4 test results and NGC ^ 32p identification results exist in the primary culture of fetal baby skin. Add the word "1mM non-label ATP" in the culture liquid to completely block the product. The results showed that the cell surface of NGC cells showed significant changes in the surface of cells. On the one hand, the cell [^ & lt;32>P] is trying to determine the current situation, and the ^ & lt;32>P tag is in the presence of the NGC 1mM non-label ATP. (the lt;32>P tag completely prevents the user from causing damage). The results of the above results, the NGC cell, the cell surface of the cell, the acidification phase, the cell surface, the cell surface and the cell surface.