固体表面に対する配向の精密制御されたタンパク質の創製

在固体表面上创建具有精确控制方向的蛋白质

• 批准号: 12019251
• 负责人: 中西 一弘
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12019251/
• 关键词: 付着; ペプチド; ラテックス; 吸着等温線; 変異RNase A; 不可逆吸着; ステンレス

タンパク質(酵素)の固体表面に対する付着は、分析、反応、生体材料設計など生物生体工学の多岐の分野においてみられれ現象であり、それぞれの応用を考える際には付着に対する親和性と配向の制御が重要な鍵となる。そこで、本研究では、タンパク質の固体表面に対する相互作用と直接付着に関与する部位の解明を行うと共に固体表面に対する親和性と配向の制御されたタンパク質の創製を最終目的としている。タンパク質として分子量が小さく、性質や立体構造が明らかにされているウシ膵臓ribonucleaseA(RNaseA)に着目して、固体表面に直接相互作用するタンパク質分子内ペプチド部位の解明と固体表面に対する親和性及び配向の制御された酵素の創製を行うために、変異RNaseAの調製法を確立すると共にその付着挙動を調べた。変異RNaseAとしては、ステンレス表面に対する付着部位と推定されている、^<47>His-Glu-Ser-Leu-Ala-Asp-Val^<57>中のAlaをAspに置換したAla55Asp変異RNaseAとGluとAspのそれぞれあるいは両方をAlaに置換した、Glu55Ala変異RNaseAとAsp55Ala変異RNaseA、及びPS Latexに対し強い付着を示す^<117>Pro-Val-His-Phe-Asp-Ala-Ser-Val^<124>中のPheをAlaに置換したPhe120Ala変異RNaseAを調製した。いずれの場合も変異RNaseA遺伝子をプラスミドpBXRに組み込んだ発現プラスミドを作成し、大腸菌(BL21)内で発現させた。培養大腸菌を回収後に超音波破砕を行い、封入体を回収した。回収した封入体を変性・再生後にイオン交換クロマトグラフィーとゲル濾過により精製した。精製酵素はSDS-PAGE上で均一であることを確認した、精製酵素の収率は10%前後であった。精製酵素のステンレス粒子及びPS Latexに対する付着特性を調べた。予備的検討の結果、予想した通りにAla55Asp変異RNaseAはステンレス粒子に対して野生型RNaseAよりも強い付着力を示したが、Phe120Ala変異RnaseAでは変化がみられなかった。

タンパク的solid surface material (enzyme) に対するpayment, analysis, reaction, biomaterial design などbioengineering の多岐の分线におThe いてみられれphenomenon であり, the それぞれの応用を考えるinterior には pays the に対するaffinity and oriented controlがimportant なKey となる.そこで、This study is about では、タンパク性的solid surface and に対するinteraction and the explanation of the direct connection and する location行うと合にsolid surface compatibilityとalignmentのcontrolされたタンパクqualityのcreationをfinal purposeとしている. The quality of the material is small, the molecular weight is small, and the three-dimensional structure is small. bonucleaseA (RNaseA) is focused on the target and directly interacts with the solid surface. The understanding of the molecular parts within the molecule and the solid surface affinity and alignment control of the enzyme The method for creating and modifying RNaseA was established, and the method for preparing the same RNaseA was established. Different RNaseA としては, ステンレス surface に対するattached part と presumed されている, ^<47> His-Glu-Ser-Leu-Ala-Asp-Val^<57>中のAlaをAspに组したAla55Asp変iso RNaseA とGlu とAsp のそれぞれあるいは両square をAla に Replacement した、Glu55Ala 変iso RNaseA とAsp55Ala 変iso RNaseA and びPS Latexに対し强いFU出す^<117>Pro-Val-His-Phe-Asp-Ala-Ser-Val^<124>中のPheをAlaに ReplacementしたPhe120Ala変different RNaseAをmodulationした.いずれのoccasionも変differentRNaseA缝子をプラスミドpBXRに组み込んだ発现プラスミドを成し, coliform (BL21) inner で発出させた. After the cultured coliform bacteria are recovered, the cells are broken by ultrasonic waves and then sealed into the body and recovered. Recycled した sealed body を変性・Regenerated にイオン exchanged クロマトグラフィーとゲルfiltered により refined した. The uniformity of the purified enzyme on SDS-PAGE has been confirmed, and the yield of the purified enzyme has been verified to be around 10%. Refined enzyme のステンレス particles and びPS Latex に対する have characteristics of をadjusted べた. The results of the prepared research, the expected results of the research, the Ala55Asp different RNaseA particles, the wild type R NaseA is strong and strong, and Phe120Ala is different. RnaseA is strong and strong.

项目成果

K.NAKANISHI, et al.: "On the Adosorption of Proteins on Solid Surfaces, a Common but Very Complicated Phenomenon"Journal of Bioscience and Bioengineering. (in press). (2001)

K.NAKANISHI 等人：“关于蛋白质在固体表面上的吸附，一种常见但非常复杂的现象”生物科学与生物工程杂志。

K.IMAMURA, et al.: "Adosorption Behavior of Amino Acids on a Stainless Steel Surface"Journal of Colloid Interface Science. 229. 237-246 (2000)

K.IMAMURA 等人：“不锈钢表面氨基酸的吸附行为”胶体界面科学杂志。