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ダイナミックな分子デザインと変異集積による制限酵素の改変

通过动态分子设计和突变积累修饰限制性内切酶

基本信息

批准号：
12019265
负责人：
木野邦器
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Waseda University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

酵素タンパク質に対する新規改変手法の方法論の構築を目的に、制限酵素BamHIの耐熱性向上をモデルとして研究を実施。Bacillus amyloliquefaciensH株の染色体DNAを抽出し、制限酵素BamHI遺伝子(bamHIR)と対応する修飾酵素遺伝子(bamHIM)を含むDNA断片を取得したが、大腸菌において一段階でクローニングすることは不可能であった。そこでbamHIMとbamHIRの個別クローニングを検討した。PCRによりbamHIMを含む約1.8kbHindIIIのDNA断片を取得し、これをpUC19に連結してプラスミドpUBMCを構築した。次に本プラスミドをE.coliDH5αMCR株に導入して得られた形質転換株を宿主としてbamHIRのクローニングを行った。PCRにより得たbamHIRを含む約1.4kbHindIIIのDNA断片を低コピーベクターpSTV28に連結し、プラスミドpSBRCを構築した。このpUBMCとpSBRCの2種のプラスミドを保有するE.coliBRの菌体内抽出液には制限酵素BamHI活性が検出され、目的遺伝子のクローニングと大腸菌での発現に成功した。しかし、粗酵素の見かけ上の熱安定性はクローンごとにまちまちであり、また希釈して活性を測定したところ限界希釈濃度に差が認められたため、クローンごとに発現強度の異なることが示唆された。以上より、変異を導入した制限酵素BamHIの解析や正確な評価、ならびにその生産を考慮すると精製ステップを新たに組み入れる必要性のあることが明らかになった。部位特異的変異の導入個所は、報告されている野生型BamHIの三次構造から算出した溶媒露出表面積やB-factor値よりアミノ酸の立体構造上の位置と揺らぎを計算し、二次構造・活性中心を加味して8ヶ所決定した。さらにその候補部位に対して、一般的にタンパク質を安定化すると考えられているアミノ酸の置換をシミュレーションして有効な置換アミノ酸を決定した。

The aim of this study was to establish a new methodology for enzyme quality control and to limit the heat resistance of BamHI. It is impossible to extract the chromosomal DNA of Bacillus amyloliquefaciens H strain, obtain DNA fragments containing the restriction enzyme BamHI gene (bamHIR) and the modification enzyme gene (bamHIM), and create a stage of cloning in Escherichia coli. Bam HIM and bam HIR are different from each other. The DNA fragment of BamHIM containing approximately 1.8 kb HindIII was obtained and pUBMC was constructed. E. coli DH5 αMCR strain was introduced into the plant. PCR analysis revealed bamHIR containing approximately 1.4 kb HindIII DNA fragment, which was linked to pSTV28 and pSBRC. The expression of BamHI activity was detected in extracts from E. coli, and the expression of target genes was successfully detected in E. coli. The heat stability of the crude enzyme is determined by the concentration of the crude enzyme. The above differences are introduced to limit the analysis of BamHI, and the production of BamHI is considered. site-specific variation is introduced into each site, and the tertiary structure of wild-type BamHI is calculated. The surface area exposed to the solvent is determined by the B-factor value of the tertiary structure of BamHI. For example, if a candidate position is selected, the quality of the candidate position is stabilized.