HIV-IVpr蛋白と相互作用する細胞内因子の同定

与 HIV-IVpr 蛋白相互作用的细胞内因子的鉴定

• 批准号: 12035227
• 负责人: 間 陽子
• 金额: $ 1.66万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12035227/
• 关键词: HIV-1 vpr; G2期arrest; アポトーシス; 核移行; Vpr結合因子; yeast two-hybrid法; Importin a,b; HHR23A

HIV-1vpr遺伝子産物のG2期arrest、アポトーシス、核移行、さらには細胞内因子との相互作用に関与するドメインを同定すると同時に、Vpr蛋白と特異的に相互作用する細胞内蛋白の単離を試みた。1.強いアポトーシス活性を持つVpr蛋白のC末端欠失変異体の解析G2期arrest能を完全に消失しているが、G1期arrest能と強いアポトーシス活性を獲得したVpr蛋白のC末端欠失変異体を見いだし、G2期arrestとアポトーシスは異なる経路で発揮される可能性を示した。同様に、野生型VprもG2期arrestとは異なる機序によるアポトーシス誘導能を有する事を明らかにした。これら一連の成果は細胞内に発現させたVpr蛋白が細胞をG2期arrestとは異なる経路でアポトーシス出来るという最初の報告である。2.yeast two-hybrid法によるHIV-1 Vpr結合因子の検索野生型Vprと同様の発現能、核膜・核への局在能を保持しているが細胞増殖抑制能を完全に消失している、Vpr17-81変異体をbaitとして、yeast two-hybrid法を行った。UNG、HHR23Aを含む5種類の既知の蛋白質と、6種類の未知の蛋白質をコードする遺伝子が同定された。この中で、HHR23Aについては、C末端側UBAドメインがVprとの結合に重要である事、さらに、この結合にはVprの二つのa-Helixドメイン内の33位のHis、67位のLeu及び74位のIleの各アミノ酸が重要であることを証明した。現在、その他のクローンについても解析を進めている。3.Vpr蛋白とImportin a,bとの相互作用の解析Vpr蛋白の核局在化には、核移行シグナルとして機能しうる2つのa-helixドメインが共に重要であることを明らかにした。In vitro translationで作製した野性型および変異型Vpr蛋白を用いてpull-down assayを行った結果、GST融合型Importin a及びbはVpr蛋白の2つ目のa-helixドメインと相互作用している事が示された。さらに、Digitonin処理をしたHeLA細胞を用いたNuclear import assayにより、Vprの2つ目のa-helixドメインは核内への移行に、1つ目のa-helixドメインは核膜局在に重要であることを明らかにした。

Traces of HIV - 1 Vpr 伝 zi chan の G2 phase arrest, ア ポ ト ー シ ス, nuclear migration, さ ら に は cell factor と の interaction に masato and す る ド メ イ ン を with fixed す る と に at the same time, と specific に Vpr protein interaction す る intracellular protein の 単 from を try み た. 1. Strong い ア ポ ト ー シ ス active を hold つ の Vpr protein C end owe lost - variant の parsing G2 can arrest を に disappear completely し て い る が, G1 phase arrest can strong と い ア ポ ト ー シ ス active を get し た の Vpr protein C end owe lost - variant を see い だ し, G2 arrest と ア ポ ト ー シ ス は different な る The で occurrence される possibility を indicates た た. With others in に, wild type Vpr も G2 arrest と は different な る machine sequence に よ る ア ポ ト ー シ ス can induce を have す る matter を Ming ら か に し た. こ れ ら の results in a row は intracellular に 発 now さ せ た Vpr protein が cell を G2 arrest と は different な る 経 road で ア ポ ト ー シ ス out る と い う の initial report で あ る. 2. The yeast two hybrid method に よ る Vpr combined with HIV - 1 factor の 検 rope wild type Vpr と with others の 発 can now, nuclear membrane nuclear へ の bureau in can keep し を て い る が cells raised colonization can inhibit を に disappear completely し て い る, Vpr17-81 - variants を bait と し て, yeast two-hybrid method を lines った. UNG, HHR23A を containing む 5 kinds の is の protein と, 6 species の の unknown protein を コ ー ド す る heritage 伝 が son be さ れ た. こ の で, HHR23A に つ い て は, C terminal side UBA ド メ イ ン が Vpr と の combining に important で あ る, さ ら に, こ の combining に は Vpr の two つ の a - Helix ド メ イ ン の in 33 の ihs, a 67 - bit の Leu and び 74 の Ile の each ア ミ ノ acid が important で あ る こ と を prove し た. Now, そ そ he <s:1> ロ ロ に に に て て を parse を into めて る る. 3. The Vpr protein と Importin a, b と の analytical Vpr protein interaction の の nuclear agency in the に は, nuclear migration シ グ ナ ル と し て function し う る 2 つ の a - helix ド メ イ ン が were important で に あ る こ と を Ming ら か に し た. In vitro translationで to prepare た wild-type および variant Vpr proteins を use で て てpull-down assayを to set った results, GST fusion type Importin The interaction between a and びb Vpr protein <s:1> 2 された order <s:1> a-helixドメ <s:1> と と と shows が て る る events が indicate された. さ ら に, Digitonin 処 Richard を し た HeLA を with い た Nuclear import assay に よ り, Vpr の 2 つ の a - helix ド メ イ ン は intranuclear へ の transitional に, 1 つ の a - helix ド メ イ ン は Nuclear membrane bureau in に important で あ る こ と を Ming ら か に し た.

项目成果

Kamata M.,and Aida Y.: "Two putative a-herical domains of human immunodeficiency virus type 1 Vpr mediate nuclear localization by at least two mechanisms."J.Virology. 74. 7179-7186 (2000)

Kamata M. 和 Aida Y.：“人类免疫缺陷病毒 1 型 Vpr 的两个假定的非螺旋结构域通过至少两种机制介导核定位。”J.Virology。

Nishizawa M.,Kamata M.,Katsumata R.,and Aida Y.: "A carboxy-teminally truncated form of the human immunodeficiency virus type 1 Vpr protein induces apoptosis via G1 cell cycle arrest."J.Virology. 74. 6058-6067 (2000)

Nishizawa M.、Kamata M.、Katsumata R. 和 Aida Y.：“人类免疫缺陷病毒 1 型 Vpr 蛋白的羧基末端截短形式通过 G1 细胞周期停滞诱导细胞凋亡。”J.Virology。

Nishizawa M.,Kamata M.,Myojin T.,Nakai Y.and Aida Y.: "Induction of apoptosis by the Vpr protein of human immunodeficiency virus type 1 occurs independently of G2 arrest of the cell cycle."Virology. 276. 16-26 (2000)

Nishizawa M.、Kamata M.、Myojin T.、Nakai Y. 和 Aida Y.：“人类免疫缺陷病毒 1 型 Vpr 蛋白诱导细胞凋亡的发生独立于细胞周期的 G2 停滞。”病毒学。