OP9cDNAライブラリーを用いた新規造血幹細胞増殖因子のクローニング

新規造血幹細胞増殖因子のクローニングを目的としてストローマ細胞OP9cDNAライブラリーを作製した。ライブラリーはレトロウィルスベクターに組み込んで、標的細胞であるNIH3T3細胞に感染させ、その培養上清の増殖誘導能、及び、マウス骨髄細胞との共培養を用いたコブルストン・アッセイを指標にして遺伝子を単離した。現在までに既知遺伝子(IL-6,Annexin II)及び未知遺伝子(clone682)を単離している。clone682は173アミノ酸からなり、Frizzledに相同性のあるmotifを有し、一部細胞上清に分泌されるが、現在までのところ、骨髄細胞に対する増殖誘導活性は検出できない。Annexin IIは大部分細胞内に存在するタンパク質であるが、一部細胞膜に発現しており、フィブリノーゲンの活性化、細胞間接着などに関与していることが示されている。また近年、細胞外マトリックスタンパク質のTenascin-Cの細胞膜受容体であることが報告され、一方でTenascin-Cの欠損したストローマ細胞の造血支持能が低下していることが報告されていることから、造血微小環境における機能に興味が持たれる。免疫染色法によりAnnexin IIがストローマ細胞の細胞膜に発現していること、また、Annexin IIに対する中和抗体及びAnnexin IIの細胞膜への結合を阻害する2種類のペプチドを用いると、OP9細胞とマウス骨髄細胞を共培養した場合のcobblestone area forming cell(CAFC)形成能の著明な低下を認めることが判明した。細胞膜型Annexin IIがストローマ細胞と造血細胞との接着、情報伝達に重要な機能を担っている可能性が示唆される。

新規造血幹細胞増殖因子のクローニングを目的としてストローマ細胞OP9cDNAライブラリーを作製した。ライブラリーはレトロウィルスベクターに組み込んで、標的細胞であるNIH3T3細胞に感染させ、その培養上清の増殖誘導能、及び、マウス骨髄細胞との共培養を用いたコブルストン・アッセイを指標にして遺伝子を単離した。現在までに既知遺伝子(IL-6,Annexin II)及び未知遺伝子(clone682)を単離している。clone682は173アミノ酸からなり、Frizzledに相同性のあるmotifを有し、一部細胞上清に分泌されるが、現在までのところ、骨髄細胞に対する増殖誘導活性は検出できない。Annexin IIは大部分細胞内に存在するタンパク質であるが、一部細胞膜に発現しており、フィブリノーゲンの活性化、細胞間接着などに関与していることが示されている。また近年、細胞外マトリックスタンパク質のTenascin-Cの細胞膜受容体であることが報告され、一方でTenascin-Cの欠損したストローマ細胞の造血支持能が低下していることが報告されていることから、造血微小環境における機能に興味が持たれる。免疫染色法によりAnnexin IIがストローマ細胞の細胞膜に発現していること、また、Annexin IIに対する中和抗体及びAnnexin IIの細胞膜への結合を阻害する2種類のペプチドを用いると、OP9細胞とマウス骨髄細胞を共培養した場合のcobblestone area forming cell(CAFC)形成能の著明な低下を認めることが判明した。細胞膜型Annexin IIがストローマ細胞と造血細胞との接着、情報伝達に重要な機能を担っている可能性が示唆される。