新しい機能性遺伝子同定技術の創出と成人病性血管障害関連遺伝子探索への応用

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本研究の目的は、任意の表現形質を担う遺伝子を機能面から系統的かつ簡便に同定する技術として代表者らが独自に考案したAntisense Display法を新しい機能性遺伝子スクリーニング技術として確立し、成人病性血管障害関連遺伝子、特に血管新生抑制性遺伝子と糖尿病で起こる血管周皮細胞喪失の原因となる遺伝子の分離に適用することである。平成12年度の研究は、当初計画どおりに遂行され、以下成果を得た。1.種々のホスホロチオエート型アンチセンス(AS)プールを調製してヒト微小血管内皮細胞の培養培地に添加し、細胞増殖変化を指標にスクリーニング条件の検討を行なった。この結果、16種の配列を含む鎖長10merのASプールが最も良好に作用したことから、以後このレパートリーをスクリーニングに用いることに決定した。2.1プールあたり16種のA3からなる計512のプールを各3μmolスケールで合成・精製し、スクリーニング用の新規アンチセンスレパートリーの調製を完了した。3.各ASプールをヒト微小血管内皮細胞の培養培地に添加し、内皮細胞の増殖促進を指標に血管新生抑制性遺伝子の一次スクリーニングを開始した。4.後期糖化反応生成物(advanced glycation endproducts,AGE)による周皮細胞喪失(pericyte loss)に関与する遺伝子のスクリーニングのためのアッセイ条件を決定した。高次スクリーニングの過程では、AS配列の鎖長を順次長くし標的配列分離の特異性を上げる等の改良を図る予定である。