酵母ミトコンドリアを巡るプロテインフラックス

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ミトコンドリアは外膜,膜間部,内膜,マトリクスの4つの区画から構成され,サイトゾルで合成されたタンパク質は外膜のTOM,内膜の少なくとも2種類のTIMとよばれるタンパク質複合体の働きによりミトコンドリアに移行し,適切なミトコンドリア内区画に配置される。取り込まれたタンパク質は,マトリクスの分子シャペロンHsp70,Hsp60の働きで機能化する。本研究では,以上のプロセスの全体像を,全ミトコンドリアタンパク質の流れ(プロテインフラックス)として網羅的に解析し,フラックスの大きさと分岐を制御する因子とメカニズムの解明の突破口を開くことをめざした。具体的にはまず500〜1000種類存在すると考えられるミトコンドリアタンパク質の同定のために,(1)酵母細胞からNycodenz密度勾配遠心を用いて高純度のミトコンドリアを単離精製し,さらに大量のミトコンドリアを可溶性膜間部,塩溶出性膜間部,マトリクス,膜画分に分画する方法を確立した。アフィニティタグをミトコンドリア表面に付け,磁気ビーズで高純度ミトコンドリアを単離・精製する方法も検討中である。(2)分画したミトコンドリアの各画分について二次元電気泳動を行い,CBB染色した各スポットを限定分解→質量スペクトルで同定することを試みた(現在データ解析中)。(3)酵母細胞から全mRNAを単離,in vitroで翻訳しRI標識タンパク質を合成した。これを基質として,in vitroで単離ミトコンドリアへの取り込み実験を行い,内膜の膜電位のある場合とない場合,プロテアーゼでミトコンドリア内に取り込まれなかったタンパク質を消化した場合としない場合の各々について,ミトコンドリアを回収して二次元電気泳動を行い,標識タンパク質のスポットを検出した。得られたスポットについて(2)のスポットとの対応付けを試みた。