p53蛋白安定化への基本転写因子TFIIHの関与

p53蛋白の安定化にTFIIHを構成するCAKによるp53のセリン33のリン酸化が寄与しているとの予想のもと、まず細胞にダメージを与えた後に免疫沈降したCAKを用いたin vitroキナーゼアッセイを施行した。ダメージの前後でCAKのGST-p53に対するセリン33リン酸化活性の増強は認められなかった。そこでやはりセリン33をリン酸化する事が知られているp38MAPキナーゼに着目し、p38MAPキナーゼ活性化に直接関与するMAPKKであるMKK6のドミナントネガティブ型(Ser207Ala,Thr211Ala)を構成的に発現させた細胞を作成した。この細胞に各種細胞ダメージを与えたところ、セリン33のリン酸化を伴わないp53の蓄積が認められ、1.セリン33のリン酸化はp53安定化には寄与しないこと、また2.in vivoではp38がp53のセリン33をリン酸化する事が明らかになった。これまでp53のセリン33をin vitroでリン酸化するキナーゼとして、CAKの他にもJNK(c-jun kinase)、p38MAPキナーゼが報告されている。今回2種類の細胞株についてp38活性を抑制するMKK6のドミナントネガティブ型を構成的に発現させ、細胞ダメージを与えているが、両者ともp53のセリン33リン酸化は認められなかった。この事はin vivoではp38MAPキナーゼがセリン33をリン酸化しており、CAK・JNKはこのリン酸化には関与していない事を示している。さらにセリン33のリン酸化を伴わないp53が蓄積した状態では通常p53により発現が誘導されるp21/WAF1の発現は認められず、3.セリン33のリン酸化は転写活性化に働き、しかもp21/WAF1の転写活性化に必須であると考えた。この他、α-アマニチンにより直接RNA polymerase IIを阻害した場合にもセリン33のリン酸化、すなわちp38MAPキナーゼの活性化が見られることから、4.転写抑制時にはそのシグナルは転写に関わる複合体よりMAPキナーゼの経路に伝えられ、その活性化に至る事が考えられた。

p53蛋白の安定化にTFIIHを構成するCAKによるp53のセリン33のリン酸化が寄与しているとの予想のもと、まず細胞にダメージを与えた後に免疫沈降したCAKを用いたin vitroキナーゼアッセイを施行した。ダメージの前後でCAKのGST-p53に対するセリン33リン酸化活性の増強は認められなかった。そこでやはりセリン33をリン酸化する事が知られているp38MAPキナーゼに着目し、p38MAPキナーゼ活性化に直接関与するMAPKKであるMKK6のドミナントネガティブ型(Ser207Ala,Thr211Ala)を構成的に発現させた細胞を作成した。この細胞に各種細胞ダメージを与えたところ、セリン33のリン酸化を伴わないp53の蓄積が認められ、1.セリン33のリン酸化はp53安定化には寄与しないこと、また2.in vivoではp38がp53のセリン33をリン酸化する事が明らかになった。これまでp53のセリン33をin vitroでリン酸化するキナーゼとして、CAKの他にもJNK(c-jun kinase)、p38MAPキナーゼが報告されている。今回2種類の細胞株についてp38活性を抑制するMKK6のドミナントネガティブ型を構成的に発現させ、細胞ダメージを与えているが、両者ともp53のセリン33リン酸化は認められなかった。この事はin vivoではp38MAPキナーゼがセリン33をリン酸化しており、CAK・JNKはこのリン酸化には関与していない事を示している。さらにセリン33のリン酸化を伴わないp53が蓄積した状態では通常p53により発現が誘導されるp21/WAF1の発現は認められず、3.セリン33のリン酸化は転写活性化に働き、しかもp21/WAF1の転写活性化に必須であると考えた。この他、α-アマニチンにより直接RNA polymerase IIを阻害した場合にもセリン33のリン酸化、すなわちp38MAPキナーゼの活性化が見られることから、4.転写抑制時にはそのシグナルは転写に関わる複合体よりMAPキナーゼの経路に伝えられ、その活性化に至る事が考えられた。