ATPアナログ認識可能な変異MAPキナーゼを利用したリン酸化基質の探索

使用能够识别 ATP 类似物的突变 MAP 激酶寻找磷酸化底物

• 批准号: 14658201
• 负责人: 仁科 博史
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14658201/
• 关键词: リン酸化酵素; ATPアナログ; MAPキナーゼ; JNK; p38; アポトーシス; ストレス; 紫外線

ERK、SAPK/JNK、p38の3種に大別されるMAPキナーゼファミリーは、様々な細胞応答に関与する主要なリン酸化酵素である。申請者らは最近、紫外線照射時のERKやJNK、p38の活性化機構やその生理的役割を検討し、ERKの活性化にはSrcからのEGF受容体の活性化という細胞膜近傍での反応が必要であること、また細胞のアポトーシス誘導の関与が示唆されているJNKやp38とは対照的に、ERKが抗アポトーシスに関与することを明らかにした(J.Biol.Chem.277;366-371,2002)。しかしながら、これらのMAPキナーゼが標的とするリン酸化分子やそれらの生理的役割については不明のままである。一般に、細胞内あるいは細胞抽出液内に存在するプロテインキナーゼの標的分子を同定することは困難な場合が多い。この原因の一つは、共存する多数多種類のキナーゼが一斉にリン酸化反応を行い、目的のリン酸化反応を覆い隠してしまうことにある。そこで本研究では、放射標識された非天然型のATPアナログの合成とこれをリン酸化反応の基質として利用可能な点変異MAPキナーゼを作製することによって、変異MAPキナーゼだけが標的分子に放射標識されたγ位のリン酸基を転移できるような実験系の開発を行った。これまでに野生型リン酸化酵素が利用できない非天然型ATPアナログを利用可能な点変異JNKは作製済みであり、同様な方法で、p38やERKの点変異体も作製した。現在これら変異体の特性を検討中である。また、細胞膜を透過しにくい非天然型ATPアナログを細胞内に導入する目的で、刺激依存的にJNKが活性化される環境を保持しつつ、非天然型ATPアナログが細胞内に取り込まれる条件を、各種可溶化剤やサポニンを用いて検討中である。

ERK, SAPK/JNK and p38 are three major enzymes involved in cellular response. Applicants have recently discussed the physiological mechanisms for activation of ERK, JNK and p38 in response to UV irradiation, and the activation of ERK in response to activation of EGF receptors in the vicinity of cell membranes.(J.Biol.Chem.277;366-371,2002)。The MAP is the target of an acid molecule, and the physiological function of an acid molecule is unknown. In general, there are many difficult situations in which target molecules are present in cell extracts. The reason for this is that most of the various types of acidification reactions are carried out in the middle of the process, and the purpose of acidification reactions is to cover the process. In this study, the synthesis of non-natural ATP molecules and the development of acid reaction systems were carried out by using possible sites of different MAP molecules. The wild-type acidifying enzyme can be produced by different methods such as p38 and ERK. Now we're talking about a different kind of behavior. For example, cell membrane permeation, non-natural ATP release, intracellular introduction, stimulus-dependent JNK activation, environmental maintenance, non-natural ATP release, intracellular selection, and various solubilizing agents are discussed.

项目成果

K.Kontani, M.Tada, T.Ogawa, T.Okai, K.Saito, Y.Araki, T.Katada: "Di-Ras : A distinct subgroup of Ras-family GTPases with unique biochemical properties"J.Biol.Chem.. 277. 41070-41078 (2002)

K.Kontani、M.Tada、T.Okawa、T.Okai、K.Saito、Y.Araki、T.Katada：“Di-Ras：具有独特生化特性的 Ras 家族 GTP 酶的独特亚组”J.Biol。

D.Kitagawa, S.Tanemura, S.Ohata, N.Shimizu, J.Seo, G.Nishitai, et al.: "Activation of extracellular signal-regulated kinase by ultraviolet is mediated through Src-dependent epidermal growth factor receptor phosphorylation"J.Biol.Chem.. 277. 366-371 (2002)

D.Kitakawa、S.Tanemura、S.Ohata、N.Shimizu、J.Seo、G.Nishitai 等人：“紫外线激活细胞外信号调节激酶是通过 Src 依赖性表皮生长因子受体磷酸化介导的”

H.Takayanagi, S.Kim, T.Koga, H.Nishina, et al.: "Induction and Activation of the Transcription Factor NFATc1 (NFAT2) Integrate RANKL Signaling"Dev. Cell. 3. 889-901 (2002)

H.Takayanagi、S.Kim、T.Koga、H.Nishina 等人：“转录因子 NFATc1 (NFAT2) 整合 RANKL 信号传导的诱导和激活”Dev。

T.Watanabe, K.Nakagawa, S.Ohata, D.Kitagawa, G.Nishitai, et al.: "SEK1/MKK4-mediated SAPK/JNK signaling participates in embryonic hepatoblast proliferation via a pathway different from NF-kappaB-induced anti-apoptosis"Dev.Biol.. 15. 332-347 (2002)

T.Watanabe、K.Nakakawa、S.Ohata、D.Kitakawa、G.Nishitai 等人：“SEK1/MKK4 介导的 SAPK/JNK 信号传导通过不同于 NF-kappaB 诱导的抗肿瘤途径参与胚胎肝细胞增殖。

Yamamoto, T.Miyazaki, Y.Kadono, H.Takayanagi, et al.: "Possible Involvement of IκB Kinase 2 and MKK7 in Osteoclastogenesis Induced by Receptor Activator of Nuclear factor κB Ligand"J.Bone Miner.Res.. 17. 612-621 (2002)

Yamamoto、T.Miyazaki、Y.Kadono、H.Takayanagi 等人：“核因子 κB 配体受体激活剂诱导的破骨细胞生成中 IκB 激酶 2 和 MKK7 的可能参与”J.Bone Miner.Res.. 17. 612 -621 (2002)