アレル特異的遺伝子発現の定量的比較による、遺伝性腫瘍の病態解明と診断に関する研究

通过等位基因特异性基因表达的定量比较研究遗传性肿瘤的发病机制和诊断

基本信息

批准号：
12217169
负责人：
村上善則
金额：
$ 3.33万
依托单位：
National Cancer Center Research Institute and Research Center for Innovative Oncology, National Cancer Center Hospital East
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は、遺伝子多型による細胞、個体の多様性の原因として、遺伝子産物の構造上の差違のみならず、遺伝子発現量や発現応答性の差違が重要であると考え、まずSSCP法を用いてアレル特異的な遺伝子発現量を高度定量的に解析できるRNA Difference Plot(RDP)法を確立した。この方法は、多型を示すゲノムDNA、並びにmRNAから得たcDNAの同一断片を、蛍光標識プライマーを用いてPCRによりそれぞれ増幅し、塩基配列自動解析装置を用いたSSCP解析により分離した後、各増幅産物の量比を測定するもので、最適条件の検討により、アレル特異的遺伝子発現量を標準偏差10%以下の制度で定量的に解析することが可能となった。そこでRDP解析を用いて、常染色体上の遺伝子の両アレルからの発現量が、正常末梢血リンパ球細胞においては、正確に等量であること、従って、アレル特異的発現量を比較、定量することにより、遺伝子の不活化変異を検出、診断することが可能であることを示した。次に、エクソン領域の一塩基多型(cSNP)を指標としたRDP解析を、遺伝性腫瘍である網膜芽細胞腫、並びに家族性非ポリポーシス性大腸がん(HNPCC)の遺伝子診断法として確立するための基礎実験、ならびに条件設定を行った。そして、臨床的に遺伝性であることが明らかであるにも関わらず、遺伝子のコード領域の塩基配列の異常を示さず、また、FISH法等によっても遺伝子欠失等の構造異常を認めないことから判定保留となっていた網膜芽細胞腫症例に関して、適当なSNPを指標としたRDP解析を行い、予備的な実験において、3例中2例で片側のアレルからのRB遺伝子の発現の選択的低下を検出した。

我们认为，不仅基因产物的结构差异差异，而且基因表达和反应性的差异也很重要，这是由于遗传多态性而引起的细胞和个体多样性的原因，因此我们首先建立了一种RNA差异图（RDP）方法，该方法允许使用SSCP方法高度定量地对等位基因基因表达水平进行高度定量分析。该方法放大了基因组DNA的相同片段，显示了使用荧光标记的引物从PCR获得的多态性和cDNA，使用自动碱基序列分析设备通过SSCP分析将它们分开，然后测量每个扩增产物的量比。通过检查最佳条件，可以在标准偏差为10％或更低的系统下定量分析等位基因特异性基因表达水平。因此，使用RDP分析，表明在正常外周血淋巴细胞细胞中，基因两个等位基因的表达量准确地相等，并且通过比较和量化特定于等位基因的表达量，可以检测和诊断基因失活突变。接下来，使用外显子区域中的单核苷酸多态性（CSNP）作为指数进行了RDP分析，并进行了基本实验，以建立用于视网膜细胞瘤，遗传性肿瘤，家族性非糖症结肠癌（HNPCC）（HNPCC）（HNPCC）的遗传诊断方法，并设置了疾病。此外，在视网膜母细胞瘤的情况下，由于临床上明显是遗传性的事实，该事实并未显示基因编码区域的核苷酸序列异常，并且没有通过适当的SNP进行选择，而没有对rdp分析进行iNtex的实验，并且没有对基因的结构异常（例如基因缺失）观察到，并且是对基因分析的进行了。在三个病例中的两个中检测到了一个等位基因的RB基因的表达。