遺伝子ベクター開発のための細胞内ソーティング素子のスクリーニング系の構築

用于基因载体开发的细胞内分选元件筛选系统的构建

• 批准号: 13218001
• 负责人: 原島 秀吉
• 金额: $ 2.94万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13218001/
• 关键词: 遺伝子カテゴリー; ソーティング; エンドソーム; 核局在化シグナル; 細胞内動態

ヒトゲノムプロジェクトの完成を間近にして,遺伝子治療の可能性に対する期待も益々大きくなることが予想される.しかしながら,これまで多数の遺伝子導入方法の開発が行われてきたにもかかわらず,ほとんど全ての研究は最終的な遺伝子発現を指標として行われ,遺伝子自体の細胞内動態はブラックボックスとなっている.我々は「細胞内動態制御シグナルの分子スクリーニングシステムを確立し,人工遺伝子キャリアーの細胞内動態を最適化する」ことが焦眉の急であると考え,そのために細胞内各オルガネラ中の遺伝子量を定量的に測定し,各素過程を速度定数で定量的に評価できるスクリーニング系を確立することを第一目標とした.申請者は,平成12年度に,本特定領域研究にて,PCR法とサザンブロッティング法を用いて核内遺伝子量を定量する新たな手法の開発に成功した(Tachibana, et al., accepted by Pharm. Res.).平成13年度は,以下のような検討を行った.1)細胞内動態の素過程の分子スクリーニングシステムの構築:細胞内の遺伝子の分布は,細胞膜,細胞質、エンドソーム、ライソゾームそして核が主要な分画である.各分画中の遺伝子量は,我々が確立したPCR法とサザンブロッティング法により定量した.この定量法に基づいて,遺伝子の細胞内動態の各素過程を速度定数として定量的に評価し,分子スクリーニングシステムを構築した.2)非ウイルスベクターの細胞内動態の最適化:細胞内動態のそれぞれの素過程について最適化した.例えば,kescに関しては最大になるように,kdeg, lys(ライソゾームでの分解)に関しては最小になるように分子設計を行った.各ステップの促進あるいは抑制は核局在化シグナルのようなシグナルペプチドや特異的脂質のオルガネラ局在化機構を導入することにより検討した.

ヒ ト ゲ ノ ム プ ロ ジ ェ ク ト の between nearly complete を に し て, heritage 伝 son treatment の possibility に す seaborne る expected も profit 々 big き く な る こ と が to think さ れ る. し か し な が ら, こ れ ま で most の heritage 伝 import means の open 発 が line わ れ て き た に も か か わ ら ず, ほ と ん ど full て の research は な of final 伝 son 発 now を index と し て line わ れ The intracellular dynamics of the 伝 subzymoid <s:1> cells are 伝 ブラッ, ボッ, スとなって and る. I 々 は "cell dynamic suppression シ グ ナ ル の molecular ス ク リ ー ニ ン グ シ ス テ ム を し, traces of artificial 伝 son キ ャ リ ア ー の cells optimal dynamic を す る" こ と が JiaoMei の urgent で あ る と え, そ の た め に cells within each オ ル ガ ネ ラ の in heritage 伝 child quantity を quantitative determination of に し, each element process を speed constant で に of quantitative evaluation of 価 で き る ス Youdaoplaceholder0 リ ニ グ グ グ is the first objective of を to establish する とを とを とを と と. Applicants は, pp.47-53 12 に, particular research に て, PCR method と サ ザ ン ブ ロ ッ テ ィ ン を グ method with い て in nuclear legacy 伝 child quantity を quantitative す る new た な gimmick の open 発 に successful し た (Tachibana, et al., accepted by Pharm. Res.). は pp.47-53 13, the following の よ う な 検 line for を っ た. 1) dynamic の element process の molecules in cells ス ク リ ー ニ ン グ シ ス テ ム の constructs: intracellular の heritage 伝 は の distribution, cell membrane, cytoplasm, エ ン ド ソ ー ム, ラ イ ソ ゾ ー ム そ し て nuclear が な main points draw で あ る. Each painting の heritage 伝 quantity は, I 々 が establish し た PCR method と サ ザ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ method に よ り quantitative し た. こ の に quantitative method base づ い て, heritage 伝 son の を dynamic の each element in the cell process speed constant と し て に of quantitative evaluation of 価 し, molecular ス ク リ ー ニ ン グ シ ス テ ム を build し た. 2) the ウ イ ル ス ベ ク タ ー の dynamic の in the cell Optimization: Optimization of intracellular dynamic <s:1> それぞれ pheromone processes に それぞれ て て て た た. Example え ば, kesc に masato し て は biggest に な る よ う に, kdeg, lys (ラ イ ソ ゾ ー ム で の decomposition) に masato し て は minimum に な る よ う に molecular design line を っ た. Each ス テ ッ プ の promote あ る い は inhibit は nuclear agency in the シ グ ナ ル の よ う な シ グ ナ ル ペ プ チ ド や specific lipid の オ ル ガ ネ ラ bureau in the institutions を import す る こ と に よ り beg し 検 た.

项目成果

R. Tachibana, H. Harashima, Y. Shinohara, H. Kiwada: "Quantitative study on intracellular fate of plasmid delivered with nonviral vectors"Adv. Drug Del. Rev.. 52. 219-226 (2001)

R. Tachibana、H. Harashima、Y. Shinohara、H. Kiwada：“用非病毒载体传递的质粒的细胞内命运的定量研究”Adv。

原島秀吉: "生物薬剤学 林正弘,谷川原祐介編集 第8章「生理学的モデル」"南江堂. 21 (2001)

原岛秀吉：“林正宏和谷川原佑介编辑的生物制药第8章“生理模型””Nankodo 21（2001）。

R. Tachibana, H. Harashima, Y. Shinohara, H. Kiwada: "Intracellular control of macromolecules by use of liposomes as drug carriers"J. Biol. Macromol. 1. 60-67 (2001)

R. Tachibana、H. Harashima、Y. Shinohara、H. Kiwada：“利用脂质体作为药物载体对大分子进行细胞内控制”J。

S. Futaki, W. Ohashi, T. Suzuki, M. Niwa, S. Tanaka, K. Ueda, H. Harashima, Y. Sugiura: "Stearylated arginine-rich peptides : A new class of transfection systems"Bioconjugate Chem.. 12. 1005-1011 (2001)

S. Futaki、W. Ohashi、T. Suzuki、M. Niwa、S. Tanaka、K. Ueda、H. Harashima、Y. Sugiura：“硬脂酰化富含精氨酸的肽：一类新的转染系统”Bioconjugate Chem..

H. Harashima, Y. Shinohara, H. Kiwada: "Controlling the Intracellular Trafficking of DNA Using Liposomes as Drug Carriers"Eur. J. Pharam. Sci.. 13. 85-90 (2001)

H. Harashima、Y. Shinohara、H. Kiwada：“使用脂质体作为药物载体控制 DNA 的细胞内贩运”Eur。