動物ゲノムのレプリコン構造解明のためのDNA複製部位可視化法の開発

开发用于阐明动物基因组复制子结构的 DNA 复制位点可视化方法

• 批准号: 13878121
• 负责人: 奥村 克純
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Mie University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13878121/
• 关键词: DNA複製; 染色体バンド構造; レプリコン; DNAファイバー; 蛍光標識; FISH

生きている動物細胞に蛍光標識ヌクレオチドを取り込ませ、複製中のDNAをラベルすることで、実際に複製が起こっているDNA領域を視覚的に検出できる技術を確立した。これを用いて、染色体DNAが間期核内でどのような順序、空間的配置で複製されるのかを詳細に解析した。その結果、細抱周期のS期が進むにつれて複製部位が核の内部から外部へと徐々に移動し、それが分裂期染色体のR/Gバンド構造と密接に関連していることを明らかにした。このことから、染色体DNAが一見無秩序に詰め込まれているような間期核内でも、それらは高度に組織化され、DNA複製制御と密接に関わっていると推定した。また、この方法で複製ラベルしたDNAを細胞核からファイバー状に引きのばし、より高解像度でDNA複製を解析できる技術を確立した。これにより、数千〜数十万塩基対の間隔でゲノム上に存在する複製開始領域を明確に検出することに成功した。これを用いて、細胞周期を同調した培養細胞でS期の最も初期に活性化される染色体複製ドメインを詳細に解析した結果、一つの複製ドメインを構成する複数のレプリコンのうち、最初に活性化されるレプリコンと、最初に活性化されたものに影響を受けて少し遅れて活性化されるレプリコンの二種類が存在することを明らかにした。また、細胞周期ごとに異なる標識を用いて複製ドメインを検出することで、複製ドメイン及び個々のレプリコンの利用(活性化)頻度を調べた結果、特定の複製ドメインはどの細胞周期でも安定に活性化される傾向にあったが、複製開始部位はそれほど厳密に決定されていないことを明らかにした。さらにFISH法と組み合わることにより特定のゲノム領域の解析ができるかを検討したところ、数十万塩基対にわたるマウスメジャーサテライト反復配列のみならず、1コピーしかないロドプシン遺伝子領域においても複製ドメインの構造を解析することに成功した。

Raw animal cell light mark ヌクレオチドをtake り込ませ, copying DNA をラベルすることで、実记に replicated がこっているThe に検出できるtechnology in the field of DNA has been established した. Detailed analysis of chromosomal DNA's interphase nuclear sequence and spatial arrangement and copying. The result of the その, the S period of the fine embrace cycle, the advance, the copy part, the core, the internal part, the external part, the movementし、それが Mitosis chromosome のR/Gバンド structure and close connection していることを明らかにした.このことから、Chromosome DNA が一见无码に诘め込まれているようなinterphase nuclear でも, It is highly organized and DNA replication control is closely connected and it is presumed that it is closely connected.また、この Method でCopy ラベルしたDNAをNucleus からファイバー-like にHigh-resolution DNA replication and analysis technology has been established.これにより, thousands to hundreds of thousands of 塩対のinterval でゲノム上にexisting するcopy start field をclear に検出することにsuccess した.これをUsing いて, cell cycle synchronization and したcultivated cells, でS phase and the initial stage, activating and される staining The result of the detailed analysis of the body copy code and the structure of the one copy code and the complex number codeコンのうち, Initial activation of されるレプリコンと, Initial activation of されたものにeffectをIt is activated by the two kinds of けて小し遅れてactivationされるレプリコンのがexistent することを明らかにした.また、Cell cycle ごとに Different なる logo を Use いて to copy ドメインを検出することで, Copy the results of the use (activation) frequency of the ドメイン and the 々のレプリコンの, Specific replication control, cell cycle control, stabilization, activation, and tendency of cell cycle control.が、The copy start position is determined by the secret of the copy. FISH method and combination analysis of specific fieldsができるかを検多したところ、hundreds of thousands of 塩対にわたるマウスメジャーサテライト Repeated arrangement of のみならず, 1コピーしかないロドプシン remain伝子区においても copy ドメインのstructuralをanalyzeすることにsuccessfulした.

项目成果

Morihiro Ito: "Up-regulated Expression of a Novel Gene in Activated Human Peripheral Blood Mononuclear Cells That is a Truncated Paralog of the Human System L Amino Acid Transporter 1"International Journal of Biochemistry and Cell Biology. (印刷中).

Morihiro Ito：“激活的人外周血单核细胞中新基因的表达上调，该基因是人类系统 L 氨基酸转运蛋白 1 的截短旁系同源物”《国际生物化学和细胞生物学杂志》（正在出版）。

Shin-ichiro Takebayashi: "5-Aza-2'-deoxycytidine Induces Histone Hyperacetylation of Mouse Centromeric Heterochromatin by a Mechanism Independent of DNA Demethylation"Biochemical Biophysical Research Communications. 288巻4号. 921-926 (2001)

Shin-ichiro Takebayashi：“5-Aza-2-脱氧胞苷通过独立于 DNA 去甲基化的机制诱导小鼠着丝粒异染色质的组蛋白过度乙酰化”《生化生物物理研究通讯》第 288 卷，第 4. 921-926 期（2001 年）。

Atsushi Kohda: "Preparation of Extended Metaphase Chromosomes from Human Cultured Cells Using a Topoisomerase II Inhibitor,ICRF-193"Bioscience,Biotechnology and Biochemistry. 65巻5号. 1248-1251 (2001)

Atsushi Kohda：“使用拓扑异构酶 II 抑制剂 ICRF-193 从人类培养细胞中制备延伸的中期染色体”《生物科学》、《生物技术和生物化学》第 65 卷，第 5 期。1248-1251 (2001)

Kazuhiro Kagotani: "Visualization of Transcription-dependent Association of Imprinted Genes with the Nuclear Matrix"Experimental Cell Research. (印刷中).

Kazuhiro Kagotani：“印记基因与核基质的转录依赖性关联的可视化”实验细胞研究（正在出版）。

Kazuhiro Kagotani: "Replication Timing Properties within the Mouse Distal Chromosome7 Imprinting Cluster"Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. (印刷中).

Kazuhiro Kagotani：“小鼠远端染色体 7 印记簇内的复制计时特性”生物科学、生物技术和生物化学（正在出版）。