真核細胞ゲノム上の複製ドメイン・レプリコンの複製機序の解明

阐明真核基因组复制域和复制子的复制机制

• 批准号: 11239204
• 负责人: 奥村 克純
• 金额: $ 30.85万
• 依托单位: Mie University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11239204/
• 关键词: DNA複製; 複製フォーク; DNAファイバー; チェックポイント; 核マトリックス; 分子コーミング; インプリンティング; 複製ファクトリー; レプリコン; 動物細胞; ゲノム; FISH; 転写装置; 核マトリクス; 出芽酵母; 染色体バンド構造; 動物細胞ゲノム; DNA replication; genome structure; DNA fiber; heterochromatin

(1)ヒトおよびマウスの培養細胞を用いて、細胞周期S期の進行に伴う複製の進行過程を、S期における複製タイミングと複製部位の核内配置、染色体バンド構造、さらに複製フォークの進行速度について解析し、これらが密接に関連することを明らかにした。特に、複製フォークの進行速度がS期の初期から中期にかけて一端減速し、後期に最も速くなることを、独自に開発したDNAファイバー上で複製フォークの進行速度を測定する方法により明らかにした。すなわち、染色体上でS期初期に複製するRバンド領域からS期後期に複製するGバンド領域の境界のR/G遷移領域、およびマウス細胞のセントロメアヘテロクロマチン周辺領域の複製フォークの進行速度か最も遅くなることを見出した。また、マウス・セントロメアヘテロクロマチン周辺領域の複製起点の活性化と複製フォークの進行速度はヒストンのアセチル化により制御されていることを明らかにした。さらに、カンプトテシン(CPT)処理によるDNA損傷時に作動するチェックポイント制御についても検討し、各種特異的阻害剤存在下での複製フォーク速度やDNA合成量を調べる実験から、DNA損傷時に、S期チェックポイント因子PI3KKが複製開始点の抑制と複製フォークの安定性に貢献することを見出した。(2)複製・転写等の核内イベントへの核マトリックスの関与を明らかにするため、転写誘導される熱ショックタンパク質HSP70遺伝子領域の核マトリックスとの結合状態について転写ファクトリーを含めたモデルを提示すると共に、転写されないゲノム領域が、複製前に核マトリックスに結合し、複製後に直ちに離れることを明らかにした。(3)分子コーミング技術を確立し、DNAファイバー上での複製解析へ応用する一方、インプリント遺伝子の複製がアリル間で非同調的なタイミングで複製することを独自の方法で証明した。

(1) ヒ ト お よ び マ ウ ス の culture cell を with い て and cell cycle phase S の に う copy の process を, S phase に お け る copy タ イ ミ ン グ と の core configuration, chromosome copy parts バ ン ド structure, さ ら に copy フ ォ ー ク の speed に つ い て analytical し, こ れ ら が contact に masato even す る こ と を Ming ら か に し た. に, copy フ ォ ー ク の speed が S early period の か ら medium-term に か け し て end reducer, late に most も speed く な る こ と を, alone に 発 し た DNA フ ァ イ バ ー で replicated フ ォ ー ク の speed を determined す る method に よ り Ming ら か に し た. On で す な わ ち, chromosome S early stage に copy す る R バ ン ド field か ら S period late に copy す る G バ ン ド areas の realm の R/G migration, お よ び マ ウ ス cells の セ ン ト ロ メ ア ヘ テ ロ ク ロ マ チ ン weeks 辺 field の copy フ ォ ー ク の か to speed the も 遅 く な る こ と を shows し た. ま た, マ ウ ス · セ ン ト ロ メ ア ヘ テ ロ ク ロ マ チ ン weeks 辺 field の copy starting point の activeness と copy フ ォ ー ク の speed は ヒ ス ト ン の ア セ チ ル change に よ り suppression さ れ て い る こ と を Ming ら か に し た. さ ら に, カ ン プ ト テ シ ン (CPT) 処 Richard に よ る DNA damage when moving に す る チ ェ ッ ク ポ イ ン ト suppression に つ い て も beg し 検, specific resistance against the presence of tonic で の copy フ ォ ー ク speed や amount of DNA synthesis を adjustable べ る be 験 か ら, when DNA damage に, S phase チ ェ ッ ク ポ イ ン ト factor PI3KK が copy starting point の Inhibition of と replication フォ する <s:1> <s:1> stability に contribution する た とを seen in た た. , (2) copy planning, writing and other の intranuclear イ ベ ン ト へ の nuclear マ ト リ ッ ク ス の masato Ming ら を か に す る た め, planning to write induced さ れ る hot シ ョ ッ ク タ ン パ ク qualitative HSP70 heritage 伝 sub-fields の nuclear マ ト リ ッ ク ス と の combining state に つ い て planning write フ ァ ク ト リ ー を containing め た モ デ ル を prompt す る と に, planning to write さ れ な い ゲ ノ が ム field, Before copying に nuclear マ ト リ ッ ク ス に し, copy after に straight ち に from れ る こ と を Ming ら か に し た. (3) molecular コ ー ミ ン グ し を established technology, DNA フ ァ イ バ ー on で の copy parsing へ 応 with す る side, イ ン プ リ ン ト posthumous son 伝 の copy が ア リ ル で incoherent between な タ イ ミ ン グ で copy す る こ と を の way alone で prove し た.

项目成果

Masaki Ishida: "DNA Fluorescence In Situ Hybridization in Paramecium : Telomere Localization in Macronucleus"Zoological Science. 17巻. 1289-1295 (2000)

Masaki Ishida：“草履虫 DNA 荧光原位杂交：大核中的端粒定位”《动物学科学》，第 17 卷，1289-1295（2000 年）。

奥村 克純: "クロマチン構造とDNA複製"生体の科学. 54巻3号. 185-191 (2003)

Katsumi Okumura：“染色质结构和 DNA 复制”《生物科学》第 54 卷，第 3. 185-191 期（2003 年）。

Kazuhiro Kagotani: "Visualization of Transcription-dependent Association of Imprinted Genes with the Nuclear Matrix"Experimental Cell Research. (印刷中).

Kazuhiro Kagotani：“印记基因与核基质的转录依赖性关联的可视化”实验细胞研究（正在出版）。

Teijiro Aso: "Structural Organization and Chromosome Location of the Mouse Elongin A Gene(Tceb3)"Cytogenetics Cell Genetics. 86巻3-4号. 259-262 (1999)

Teijiro Aso：“小鼠 Elongin A 基因 (Tceb3) 的结构组织和染色体位置”《细胞遗传学》第 86 卷，第 259-262 期（1999 年）。

Naoyuki Fujita: "Methylation-mediated Transcriptional Silencing in Euchromatin by Methyl-CpG Binding Protein MBD1 Isoforms"Molecular and Cellular Biology. 19巻9号. 6415-6426 (1999)

Naoyuki Fujita：“甲基化介导的常染色质转录沉默”，《分子与细胞生物学》，第 19 卷，第 6415-6426 期（1999 年）。