FISHによるマルチレプリコンの複製開始制御機構解析法の確立

FISH分析多复制子复制起始控制机制的方法建立

• 批准号: 10162205
• 负责人: 奥村 克純
• 金额: $ 1.66万
• 依托单位: Mie University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10162205/
• 关键词: FISH; Replicon; DNA fiber; Bromodeoxyuridine; Histone acetylation; DNA replication

本研究では、真核性染色体のもつ特徴であるマルチレプリコンの複製開始制御機構を明らかにするための新しい解析技術を、蛍光in situ hybridization(FISH)法を駆使して確立することを目指し、以下のように展開した。DNAファイバー上でのBrdU検出とFISHを併用することにより、数kbの解像度をもつ複製の進行過程を数百kbの範囲で個々の細胞で視覚的に追跡できるファイバーFISHによるレプリコン解析法の開発を行った。本年度は、基本的方法ではファイバーの検出時にDNAの一部の脱落が起こり、安定したシグナル検出ができない点を踏まえ、まず、本法の技術的基盤を見直した。ファイバー検出時のDNAの変性方法が原因であると考え、その条件を種々検討した結果、アルカリ条件下で変性させることによって、これまでの方法ではドットのつながりとして検出されたBrdUの取り込みを、分断の少ないライン状シグナルとして検出することに成功した。また、この変性条件下で検出したDNAのFISHシグナルもライン状に検出できた。BrdUとFISHの両者の同時検出にも成功したが、BrdUの検出感度の若干の低下が認められ、この点については、さらなる検討を要する。また、生細胞核内複製fociのクロモソームテリトリー内での配置を解析するため、蛍光標識ヌクレオチドを動物細胞に直接取り込ませる方法を導入して複製fociを生細胞のまま三次元イメージングし、これを固定して、FISHを行い、用いている固定法が複製fociレベルでは問題ないことを明らかにした。また、ゲノムクローンを用いるRNA-FISHによって核内RNA一次転写産物を検出し、非同調的複製をするDiGeorge Syndrome(DGS)責任領域のクローンがbiallelicに発現していることを明らかにした。また、セントロメアへテロクロマチン領域の低アセチル化状態の維持機構として、別の場所で脱アセチル化されたヒストンが、セントロメア領域に輸送されるという機構の存在を示した。

This study で は, eukaryotic chromosome の も つ, 徴 で あ る マ ル チ レ プ リ コ ン の duplicate system royal institution を Ming ら か に す る た め の new し い parsing techniques を 蛍 light in situ hybridization (FISH) method を 駆 make し て establish す る こ と を refers し, the following の よ う に expand し た. On DNA フ ァ イ バ ー で の BrdU 検 と FISH を made す る こ と に よ り, several KB の resolution を も つ copy の process hundreds of KB を の van 囲 で a 々 の cells of the apparent 覚 で に tracing で き る フ ァ イ バ ー FISH に よ る レ プ リ コ ン analytic method の open 発 を line っ た. は this year, the basic method of で は フ ァ イ バ ー の 検 out に DNA の fall off a の が up こ り, stable し た シ グ ナ ル 検 out が で き な い tread point を ま え, ま ず の technology of base plate, this law を see straight し た. フ ァ イ バ ー 検 out の DNA の way が - sex で あ る と え test, そ を の conditions of 々 beg し 検 た results, ア ル カ で リ conditions - sex さ せ る こ と に よ っ て, こ れ ま で の way で は ド ッ ト の つ な が り と し て 検 out さ れ た BrdU の take り 込 み を, less the breaker の な い ラ イ ン shape シ グ ナ ル と し て 検 out す る こ と Youdaoplaceholder0 success た. Under the conditions of また and <s:1> <s:1> variation, で検 results in <s:1> たDNA に検 FISHシグナ シグナ ラ ラ ラ <s:1> <s:1> in に検 form に検 results in で た た. BrdU と FISH の struck is の simultaneously 検 に も successful し た が, BrdU の 検 out sensitivity low の several の が recognize め ら れ, こ の point に つ い て は, さ ら な る beg を 検 to す る. ま た, copy foci in the nuclei の ク ロ モ ソ ー ム テ リ ト リ ー within で の configuration を parsing す る た め 蛍 light logo ヌ ク レ オ チ ド を animal cell に directly take り 込 ま せ る method を import し て copy foci を living cells の ま ま three-d イ メ ー ジ ン グ し, こ れ を fixed し て, FISH line を い, use い て い る が after fixed method To solve the fociレベ で で な problem な とを とを problem ら に に た た. ま た, ゲ ノ ム ク ロ ー ン を with い る RNA - FISH に よ っ て nuclear RNA in a planning to write a product を 検 し, incoherent replication を す る DiGeorge Syndrome (DGS) responsibility areas の ク ロ ー ン が biallelic に 発 now し て い る こ と を Ming ら か に し た. ま た, セ ン ト ロ メ ア へ テ ロ ク ロ マ チ ン field の low ア セ チ ル change state の keep agency と し て, don't place の で ア セ チ ル change さ れ た ヒ ス ト ン が, セ ン ト ロ メ ア field に conveying さ れ る と い う institutions の を shown し た.

项目成果

Sachiko Kitanaka: "Inactivating Mutations in the 25-Hydroxyvitamin D3 1α-Hydroxylase gene in Patients with Pseudovitamin D-Deficiency Rickets" New England Journal of Medicine. 338巻. 653-661 (1998)

Sachiko Kitanaka：“假性维生素 D 缺乏性佝偻病患者 25-羟基维生素 D3 1α-羟化酶基因的失活突变”《新英格兰医学杂志》338. 653-661 (1998)。

Takashi Shiina: "Physical Mapping between the S and HLA-E Genes in the Human MHC Class I Region:Construction of a BAC,PAC and Cosmid Contig" Immunogenetics. 48巻. 402-407 (1998)

Takashi Shiina：“人类 MHC I 类区域中 S 和 HLA-E 基因的物理映射：BAC、PAC 和粘粒重叠群的构建”免疫遗传学 48. 402-407 (1998)。

Katsuzumi Okumura: "Chromosomal Localization of Human DNA-binding Nuclear Protein(NP220)to 2P13.1-p13.2 by Fluorescence in situ Hybridization" Bioscience,Biotechnology and Biochemistry. 62巻. 1640-1642 (1998)

Katsuzumi Okumura：“通过荧光原位杂交将人类 DNA 结合核蛋白 (NP220) 染色体定位到 2P13.1-p13.2”《生物科学、生物技术和生物化学》62。1640-1642 (1998)。

Yasushi Taniguchi: "Nucleotide Sequence of the Ring3 Gene in the Class II Region of the Mouse MHC and Its Abundant Expression in Testicular Germ Cells" Genomics. 51巻. 114-123 (1998)

Yasushi Taniguchi：“小鼠 MHC II 类区域中 Ring3 基因的核苷酸序列及其在睾丸生殖细胞中的丰富表达”基因组学 51. 114-123 (1998)。

Shin Ogata: "Effects of Poly(ADP-ribose)polymerase Inhibitors and NAD on the Apoptosis Induced by Actinomycin D in Human Leukemia Cells HL-60" Bulletin of the Faculty of Bioresources Mie University. (印刷中).

Shin Ogata：“聚（ADP-核糖）聚合酶抑制剂和 NAD 对放线菌素 D 诱导的人白血病细胞 HL-60 细胞凋亡的影响”三重大学生物资源学院通报（正在出版）。