重複したゲノム由来のcDNAクローンをマッピングする手法の開発

开发从重复基因组衍生的 cDNA 克隆图谱方法

• 批准号: 02F00508
• 负责人: 原田 久也
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02F00508/
• 关键词: ゲノムの重複; cDNA; EST; PCR; DNA多型; CAPSマーカー; dCAPSマーカー; 連鎖地図; DNAマーカー; 遺伝子座特異的マーカー

cDNAマーカーはQTL解析、連鎖地図に基づく遺伝子の単離、シンテニー解析のために極めて重要である。特にゲノムが重複している植物種では遺伝子座特異的なcDNAマーカーが必要である。本研究ではダイズのcDNAクローンの3'部分塩基配列を用いて、遺伝子特異的なPCR産物を得る手法を開発し、PCR産物の多型を解析して連鎖地図上に位置づけることを目標とする。本年度はダイズ登熟種子に由来するcDNAクローンの3'末端部分塩基配列の決定を完了して、それに基づき遺伝子特異的なPCR産物の多型を解析する手法を検討することが目的である。5'末端からの部分塩基配列を決定してあるダイズ登熟種子由来の約400クローンについて昨年と同じ手法により3'部分塩基配列を決定した。ダイズの2品種「ミスズダイズ」と「秣食豆公503」のゲノムDNAを平滑末端制限酵素AluI、DraI、EcoRV、HaeIII、RsaI、SspIで処理してアダプターを結合した。アダプターと3'非翻訳領域の配列をプライマーとして最初のPCRを行い、更にその産物を鋳型として、さらに内側の2つのプライマーを用いたnested PCRにより特異的な断片を増幅した。増幅断片の多型を断片長解析、SSCP法を用いて解析した。しかし2品種間の多型を解析することが出来なかった。そのため塩基配列を決定した3'末端領域から、cDNAの約400bpが増幅出来るようなプライマーセットを設計し、2品種のゲノムDNAを鋳型にして増幅断片を得た。ほとんどが単一断片であったのて、ダイレクトシークエンス法により、塩基配列を決定した。塩基配列を決定できたほとんどの断片は2品種間で一塩基多型が見出された。一塩基多型が見出された周辺で、制限酵素認識部位かそれに近い配列を見出し、CAPSマーカー、またはdCAPSマーカーを作出することが出来た。今後マーカー数を増やしでマッピングを行う。

CDNA マ ー カ ー は QTL parsing, chain 図 に base づ く posthumous son 伝 の 単 from, シ ン テ ニ ー parsing の た め に め extremely important で て あ る. Trevor に ゲ ノ ム が repeat し て い る plants で は heritage 伝 stroma specific な cDNA マ ー カ ー が necessary で あ る. This study で は ダ イ ズ の cDNA ク ロ ー ン の 3 'part salt base matched with column を い て, but 伝 specific を な PCR products る gimmick を driving 発 し の polymorphism, PCR products を parsing し て chain to 図 に position づ け る こ と を target と す る. This year は ダ イ ズ thein cooked seeds に origin す る cDNA ク ロ ー ン の 3 'end part salt base with column の decided to finished を し て, そ れ に base づ き heritage 伝 の child specific な PCR product type more analytical す を る gimmick を beg す 検 る こ と が purpose で あ る. Part 5 'end か ら の salt base with column を decided し て あ る ダ イ ズ thein cooked seeds origin about 400 ク の ロ ー ン に つ い て yesterday in と じ technique with に よ り 3' part salt base with column を decided し た. ダ イ ズ の 2 varieties "ミ ス ズ ダ イ ズ" と "provender eating beans and 503" の ゲ ノ ム DNA を smooth end AluI limited enzyme preparation, DraI, EcoRV, HaeIII, RsaI, SspI で 処 Richard し て ア ダ プ タ ー を combining し た. ア ダ プ タ ー と 3 'not turn の 訳 field match column を プ ラ イ マ ー と し て の PCR を い, initially more に そ の product を type where と し て, さ ら に medial の 2 つ の プ ラ イ マ ー を with い た nested PCR に よ り な を raised fragment of specific し た. Analysis of the length of the multiple types of を fragments in the amplituder-width fragment fragment, and the SSCP method を is used to analyze the <s:1> た. The <s:1> multiple types of <s:1> な of <s:1> 2 varieties を analysis する とが とが とが results in な った った. そ の た め salt base with column を decided し た 3 'end field か ら, cDNA の about 400 bp が raised out る よ う な プ ラ イ マ ー セ ッ ト を し design, 2 varieties の ゲ ノ ム DNA を type where に し て rights of fragment を た. ほ と ん ど が 単 a fragment で あ っ た の て, ダ イ レ ク ト シ ー ク エ ン ス method に よ り, salt base with column を decided し た. The base arrangement を determines that で たほとん たほとん たほとん たほとん <s:1> fragment <e:1> 2 varieties で one base polytype が is seen in された. Map out a salt type Quito が さ れ た weeks 辺 で limitations, enzyme known parts か そ れ に nearly い match column を see し, CAPS マ ー カ ー, ま た は dCAPS マ ー カ ー を make す る こ と が た. In the future, the number of を カ カ カ を will increase by や で で ッピ ッピ グを グを う lines う.