重複したゲノム由来のcDNAクローンをマッピングする手法の開発

cDNAマーカーはQTL解析、連鎖地図に基づく遺伝子の単離、シンテニー解析のために極めて重要である。特にゲノムが重複している植物種では遺伝子座特異的なcDNAマーカーが必要である。本研究ではダイズのcDNAクローンの3'部分塩基配列を用いて、遺伝子特異的なPCR産物を得る手法を開発し、PCR産物の多型を解析して連鎖地図上に位置づけることを目標とする。本年度はダイズ登熟種子に由来するcDNAクローンの3'末端部分塩基配列の決定を完了して、それに基づき遺伝子特異的なPCR産物の多型を解析する手法を検討することが目的である。5'末端からの部分塩基配列を決定してあるダイズ登熟種子由来の約400クローンについて昨年と同じ手法により3'部分塩基配列を決定した。ダイズの2品種「ミスズダイズ」と「秣食豆公503」のゲノムDNAを平滑末端制限酵素AluI、DraI、EcoRV、HaeIII、RsaI、SspIで処理してアダプターを結合した。アダプターと3'非翻訳領域の配列をプライマーとして最初のPCRを行い、更にその産物を鋳型として、さらに内側の2つのプライマーを用いたnested PCRにより特異的な断片を増幅した。増幅断片の多型を断片長解析、SSCP法を用いて解析した。しかし2品種間の多型を解析することが出来なかった。そのため塩基配列を決定した3'末端領域から、cDNAの約400bpが増幅出来るようなプライマーセットを設計し、2品種のゲノムDNAを鋳型にして増幅断片を得た。ほとんどが単一断片であったのて、ダイレクトシークエンス法により、塩基配列を決定した。塩基配列を決定できたほとんどの断片は2品種間で一塩基多型が見出された。一塩基多型が見出された周辺で、制限酵素認識部位かそれに近い配列を見出し、CAPSマーカー、またはdCAPSマーカーを作出することが出来た。今後マーカー数を増やしでマッピングを行う。

cDNAマーカーはQTL解析、連鎖地図に基づく遺伝子の単離、シンテニー解析のために極めて重要である。特にゲノムが重複している植物種では遺伝子座特異的なcDNAマーカーが必要である。本研究ではダイズのcDNAクローンの3'部分塩基配列を用いて、遺伝子特異的なPCR産物を得る手法を開発し、PCR産物の多型を解析して連鎖地図上に位置づけることを目標とする。本年度はダイズ登熟種子に由来するcDNAクローンの3'末端部分塩基配列の決定を完了して、それに基づき遺伝子特異的なPCR産物の多型を解析する手法を検討することが目的である。5'末端からの部分塩基配列を決定してあるダイズ登熟種子由来の約400クローンについて昨年と同じ手法により3'部分塩基配列を決定した。ダイズの2品種「ミスズダイズ」と「秣食豆公503」のゲノムDNAを平滑末端制限酵素AluI、DraI、EcoRV、HaeIII、RsaI、SspIで処理してアダプターを結合した。アダプターと3'非翻訳領域の配列をプライマーとして最初のPCRを行い、更にその産物を鋳型として、さらに内側の2つのプライマーを用いたnested PCRにより特異的な断片を増幅した。増幅断片の多型を断片長解析、SSCP法を用いて解析した。しかし2品種間の多型を解析することが出来なかった。そのため塩基配列を決定した3'末端領域から、cDNAの約400bpが増幅出来るようなプライマーセットを設計し、2品種のゲノムDNAを鋳型にして増幅断片を得た。ほとんどが単一断片であったのて、ダイレクトシークエンス法により、塩基配列を決定した。塩基配列を決定できたほとんどの断片は2品種間で一塩基多型が見出された。一塩基多型が見出された周辺で、制限酵素認識部位かそれに近い配列を見出し、CAPSマーカー、またはdCAPSマーカーを作出することが出来た。今後マーカー数を増やしでマッピングを行う。