重複したゲノム由来のcDNAクローンをマッピングする手法の開発

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CDNAマーカーはQTL解析、連鎖地図の基づく遺伝子の単離、シンテニー解析のために極めて重要である。特にダイズやコムギのようにゲノムが重複している植物種では遺伝子座特異的なcDNAマーカーが必要である。本研究ではダイズのcDNAクローンの5‘および3'末端領域部分塩基配列を用いて、遺伝子座特異的なPCR産物を得る手法を開発し、PCR産物の多型を解析して連鎖地図上に位置づけることを目標とする。本年度はダイズのcDNAの両末端領域の塩基配列を用いて、遺伝子の大部分を含む領域を増幅して、増幅産物の多型を解析する手法を検討することが目的である。5‘末端、3'末端領域の部分塩基を決定したダイズ登熟種子由来のクローンについて、遺伝子の大部分を増幅できるようにプライマーを設計した。増幅産物を2つの制限酵素のセット、(AluI, HaeIII)、(HhoI, SspI)、(ApaI, RsaI)、(DraI, XbaI)、(EcoRV, XhoI)、(HindIII, MspI)で二重消化した。消化したDNA断片を1.5%アガロースゲルまたは濃縮層を持った13%非変性ポリアクリルアミドゲルで泳動して断片長多型を解析した。断片長多型が得られない場合は、消化したDNA断片を熱変性した後、4℃で5%グリセロールを含む8%非変性ポリアクリルアミドゲルで泳動して、SSCPを解析した。両親で多型が得られた場合はF2集団92個体を用いて連鎖解析を行なった。解析した70のプライマーペアのうち、両親間で断片長多型が得られたものは、アガロースゲルで3、ポリアクリルアミドゲルで3、SSCPが確認できたものが2であった。そのうち6つのcDNAクローンを連鎖地図上に位置づけた。今後は多型検出感度を高めるために、MDEゲル等を用いる必要があると考えられる。