遺伝子治療を目指した膜透過・チャンネル形成ペプチドのベクターとしての可能性
膜穿透和通道形成肽作为基因治疗载体的潜力
基本信息
- 批准号:14771267
- 负责人:
- 金额:$ 2.11万
- 依托单位:
- 依托单位国家:日本
- 项目类别:Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
- 财政年份:2002
- 资助国家:日本
- 起止时间:2002 至 2003
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:
项目摘要
遺伝子治療における遺伝子導入ベクターの開発を目的として本研究を行なった.1.ペプチドベクターのデザインと合成,アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)の細胞内導入の検討チャンネル形成,膜透過機能を有する部位と静電的にオリゴヌクレオチドと結合する塩基性リンカー部位をデザインし,7種類のペプチド(P-1〜P-7)をFmoc固層合成法で合成した.P-1:Ac-U-N-I-I-U-P-L-L-U-P-I-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-OH;P-2:Ac-U-N-I-I-U-P-L-L-U-P-I-NH(CH_2)_2N(CH_3)_2;P-3:Ac-U-U-U-U-U-U-U-U-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-OH;P-4:Ac-U-U-U-U-U-U-U-U-P-K-S-K-R-K-V-OH;P-5:Ac-U-U-U-U-U-U-U-U-G-NH(CH_2)_2N(CH_3)_2;P-6:Ac-U-A-U-A-U-A-Q-U-L-U-G-U-U-P-V-U-B-E-Q-F-NH(CH_2)_2N(CH_3)_2;P-7:Ac-U-A-U-A-U-A-Q-U-L-U-G-U-U-P-V-U-B-E-Q-F-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-OH.蛍光ラベル化-AON/ペプチドを種々のモル比でプレインキュベーションし複合体を形成させ,AON/ペプチド複合体をNIH3T3,A549細胞に投与した.37℃,2hrインキュベーションした後,共焦点レーザー顕微鏡でAONの細胞内移行性及び細胞内分布を,フローサイトメーターで導入率を検討した.また,AON/ペプチド複合体の細胞毒性を乳酸脱水素酵素(LDH)の漏出を測定することにより行なったNIH3T3細胞では,AON/PI=1/10〜1/15の間で,AON/P7=1/10でLDHの漏出なしにAONの膜透過性が認められ,細胞質,核への分布が観察された.しかし導入率の点においては,リポソームベクターであるlipofectamineより低かった.またこの現象は,エンドサイトーシスが抑制される低温条件下でもAONの膜透過性が観察された.他のペプチドにおいては,AONの膜透過性は認められなかった.一方,A549細胞においては,すべてのペプチドで細胞毒性のない範囲内でのAONの細胞内への移行が観察されなかった.2.物理化学的手法を用いたAON透過機構の解明AON透過機構解析の基礎的な知見として,溶液中,リポソーム中でのP1,P7のコンフォメーション解析をCDスペクトルを用いて検討した.溶液中においては,両ペプチドともランダムコイル状態,一方リポソーム中ではヘリックス構造に変化することがわかった.3.総括:本ペプチドが従来のベクターとは異なったメカニズムでAONの細胞内導入を可能にしたことは,アンチセンス療法の発展に寄与できる可能性があると考えられる.
Heritage 伝 son treatment に お け る heritage 伝 son import ベ ク タ ー の open 発 を purpose と し て this research line を な っ た. 1. ペ プ チ ド ベ ク タ ー の デ ザ イ ン と synthesis, ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド (AON) import の cell の beg チ 検 ャ ン ネ ル formation, membrane through function を す る parts と electrostatic に オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド と combination す る salt basic リ ン カ ー parts を デ ザ イ ン し, 7 species の ペ プ チ ド ~ P (P - 1-7) を Fmoc solid layer synthesis で synthesis し た. : P - 1 Ac - U - N - I - I - U - P - L - L - U - - K - K - P - I - K K - K - K - K - K - K - K - OH; P-2:Ac-U-N-I-I-U-P-L-L-U-P-I-NH(CH_2)_2N(CH_3)_2; P-3:Ac-U-U-U-U-U-U-U-U-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-OH; P-4:Ac-U-U-U-U-U-U-U-U-P-K-S-K-R-K-V-OH; P-5:Ac-U-U-U-U-U-U-U-U-G-NH(CH_2)_2N(CH_3)_2; P-6:Ac-U-A-U-A-U-A-Q-U-L-U-G-U-U-P-V-U-B-E-Q-F-NH(CH_2)_2N(CH_3)_2; P-7:Ac-U-A-U-A-U-A-Q-U-L-U-G-U-U-P-V-U-B-E-Q-F-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-OH. 蛍 light ラ ベ ル - AON / ペ プ チ ド を kind 々 の モ ル than で プ レ イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し complex を form さ せ, AON / ペ プ チ ド complex を NIH3T3, A549 cells に cast and し た. 37 ℃, 2 hr イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た after total focus レ ー ザ ー 顕 micromirror で AON の migration and び cells in the cell Distribution within を, フ ロ ー サ イ ト メ ー タ ー で import rate を beg し 検 た. ま た, AON / ペ プ チ ド complex の cytotoxicity を lactic acid dehydration vegetable enzyme (LDH) leakage from の を determines す る こ と に よ り line な っ た NIH3T3 cells で は, AON/PI = 1/10 ~ 1/15 の で, AON/P7 = 1/10 で LDH の leakage な し に AON の membrane permeability が recognize め ら れ, cytoplasm, nuclear へ の distribution が 観 examine さ れ た. し か し import rate の point に お い て は, リ ポ ソ ー ム ベ ク タ ー で あ る lipofectamine よ り low か っ た. ま た こ は の phenomenon, エ ン ド サ イ ト ー シ ス が inhibit さ れ る under the condition of low temperature で も AON の membrane permeability Youdaoplaceholder0 check された. He <s:1> ペプチドにお て て,AON <s:1> membrane permeability められな った. Side, A549 cells に お い て は, す べ て の ペ プ チ ド で cytotoxicity の な い van 囲 within で の AON の intracellular へ の transitional が 観 examine さ れ な か っ た. 2. Physical and chemical methods を with い た AON through institutions の interpret AON through mechanism analytical の な knowledge と し て, solution in リ ポ ソ ー ム in で の P1, P7 の コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン parsing を CD ス ペ ク ト ル を with い て beg し 検 た. Solution に お い て は, struck ペ プ チ ド と も ラ ン ダ ム コ イ ル state, one party リ ポ ソ ー ム in で は ヘ リ ッ ク に ス structure - the す る こ と が わ か っ た. 3. 総 enclosed: this ペ プ チ ド が 従 to の ベ ク タ ー と は different な っ た メ カ ニ ズ ム で AON の cells may import を に し た こ と は, ア ン チ セ ン ス therapy の 発 exhibition に send で き る possibility が あ る と exam え ら れ る.
项目成果
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专著数量(0)
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专利数量(0)
和田俊一: "A Novel II-residual Peptaibol-Derived Carrier Peptide for in vitro Oligodeoxynucleotide Delivery into Cell"Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 14・10. 2563-2566 (2004)
Shunichi Wada:“用于体外寡脱氧核苷酸递送到细胞中的新型 II 残留 Peptaibol 衍生载体肽”生物有机与药物化学快报 14・10(2004 年)。
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和田 俊一
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和田 俊一
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2007 - 期刊:
- 影响因子:0
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Shun-ichi Wada;Yasunari Hitora;Reiko Tanaka;Hidehito Urata;和田 俊一;Shun-ichi Wada and Reiko Tanaka;Shun-ichi Wada(和田俊一);和田 俊一;Shun-ichi;和田 俊一;和田 俊一 - 通讯作者:
和田 俊一
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