遺伝子治療を目指した膜透過・チャンネル形成ペプチドのベクターとしての可能性

膜穿透和通道形成肽作为基因治疗载体的潜力

• 批准号: 14771267
• 负责人: 和田 俊一
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Osaka University of Pharmaceutical Sciences
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14771267/
• 关键词: ペプチドベクター; アンチセンスオリゴヌクレオチド; 遺伝子治療; ペプチド; オリゴヌクレオチド; ベクター

遺伝子治療における遺伝子導入ベクターの開発を目的として本研究を行なった.1.ペプチドベクターのデザインと合成,アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)の細胞内導入の検討チャンネル形成,膜透過機能を有する部位と静電的にオリゴヌクレオチドと結合する塩基性リンカー部位をデザインし,7種類のペプチド(P-1〜P-7)をFmoc固層合成法で合成した.P-1:Ac-U-N-I-I-U-P-L-L-U-P-I-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-OH;P-2:Ac-U-N-I-I-U-P-L-L-U-P-I-NH(CH_2)_2N(CH_3)_2;P-3:Ac-U-U-U-U-U-U-U-U-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-OH;P-4:Ac-U-U-U-U-U-U-U-U-P-K-S-K-R-K-V-OH;P-5:Ac-U-U-U-U-U-U-U-U-G-NH(CH_2)_2N(CH_3)_2;P-6:Ac-U-A-U-A-U-A-Q-U-L-U-G-U-U-P-V-U-B-E-Q-F-NH(CH_2)_2N(CH_3)_2;P-7:Ac-U-A-U-A-U-A-Q-U-L-U-G-U-U-P-V-U-B-E-Q-F-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-OH.蛍光ラベル化-AON/ペプチドを種々のモル比でプレインキュベーションし複合体を形成させ,AON/ペプチド複合体をNIH3T3,A549細胞に投与した.37℃,2hrインキュベーションした後,共焦点レーザー顕微鏡でAONの細胞内移行性及び細胞内分布を,フローサイトメーターで導入率を検討した.また,AON/ペプチド複合体の細胞毒性を乳酸脱水素酵素(LDH)の漏出を測定することにより行なったNIH3T3細胞では,AON/PI=1/10〜1/15の間で,AON/P7=1/10でLDHの漏出なしにAONの膜透過性が認められ,細胞質,核への分布が観察された.しかし導入率の点においては,リポソームベクターであるlipofectamineより低かった.またこの現象は,エンドサイトーシスが抑制される低温条件下でもAONの膜透過性が観察された.他のペプチドにおいては,AONの膜透過性は認められなかった.一方,A549細胞においては,すべてのペプチドで細胞毒性のない範囲内でのAONの細胞内への移行が観察されなかった.2.物理化学的手法を用いたAON透過機構の解明AON透過機構解析の基礎的な知見として,溶液中,リポソーム中でのP1,P7のコンフォメーション解析をCDスペクトルを用いて検討した.溶液中においては,両ペプチドともランダムコイル状態,一方リポソーム中ではヘリックス構造に変化することがわかった.3.総括:本ペプチドが従来のベクターとは異なったメカニズムでAONの細胞内導入を可能にしたことは,アンチセンス療法の発展に寄与できる可能性があると考えられる.

The purpose of this study is to investigate the development of gene therapy by introducing gene into cells. 1. Selection of gene and synthesis of gene, selection of gene and synthesis of gene. 7 categories of P-1: Ac-U-N-I-I-U-P-L-U-P-I-K-K-K-OH; P-2: Ac-U-N-I-I-U-L-U-P-I-K-K-K-K-OH Ac-U-N-I-I-U-P-L-L-U-P-I-NH (CH_2)_2N (CH_3)_2; P-3: Ac-U-U-K-K-OH; P-4: Ac-U-U-K-K-K-K-OH; P-4: Ac-U-U-K-K-K-K-OH; P-4: Ac-U-U-K-K-K-K-OH; P-4: Ac-U-U-K-K-OH; P-4: Ac-U-U-K-K-OH; P-K: Ac-U-U-U-U-Ac-U-U-P-K-S-K-R-K-V-OH; P-5: Ac-U-U-G-NH (CH_2)_2N (CH3) 2; P-6: Ac-U-A-Q-U-L-U-G-U-U-P-V-U-B-E-Q-F-NH (CH2) 2N (CH3) 2; P-7: Ac-U-A-Q-U-L-U-G-U-U-P-V-U-B-E-Q-F-K-K-OH. AON/PRE complex formation, AON/PRE complex NIH 3T3, A549 cells at 37 ℃, 2 hr after the initial phase, confocal migration and intracellular distribution of AON cells under microscope The introduction rate is low. The release of LDH from the AON/P7 complex was measured in NIH 3T3 cells. The release of LDH from AON/P7 = 1/10 to 1/15 was observed. The distribution of LDH in cytoplasm and nucleus was observed. The rate of penetration is very low. This phenomenon is suppressed by the membrane permeability of AON under low temperature conditions. He is the only one who has the ability to penetrate the membrane. On the one hand, A549 cells were isolated and the intracellular migration of AON was observed within the cytotoxicity range. 2. Physico-chemical methods were used to analyze the basic knowledge of AON through mechanism analysis. 3. Summary: This article reviews the possibility of introducing AON into cells and the possibility of developing AON therapy.

项目成果

和田俊一: "A Novel II-residual Peptaibol-Derived Carrier Peptide for in vitro Oligodeoxynucleotide Delivery into Cell"Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 14・10. 2563-2566 (2004)

Shunichi Wada：“用于体外寡脱氧核苷酸递送到细胞中的新型 II 残留 Peptaibol 衍生载体肽”生物有机与药物化学快报 14・10（2004 年）。