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転写促進異常症候群の分子病態解明

阐明转录异常综合征的分子发病机制

基本信息

批准号：
14771275
负责人：
石垣靖人
金额：
$ 2.56万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14771275/
关键词：
紫外線 DNA修復転写コケイン症候群 mRNA

项目摘要

生物は紫外線、放射線、化学物質などの外的要因、および生体内で生じる代謝産物などによるDNAへの損傷から生体を守り遺伝情報を正確に次世代へ伝えるために、生じたDNA損傷を取り除くDNA修復系を進化の過程で獲得してきた。常染色体劣性遺伝疾患のコケイン症候群患者由来細胞は、特に転写と共役したDNA修復機構に異常が認められるのに加えて、通常およびストレス時の転写機構に異常がみられる。本研究ではコケイン症候群原因遺伝子の機能解析を目的として、各種遺伝子発現量の検索、蛋白質の発現解析を行った。その結果、定量的RT-PCR法によりHeLa細胞との比較においてコケイン症候群細胞の各遺伝子発現量に相違が認められ、特定遺伝子のmRNA量の減少が確認された。コケイン症候群細胞の原因遺伝子にはナンセンス変異が存在するため、その変異mRNAは選択的に分解されて消失していた。この選択的変異mRNA分解機構をシクロヘキシミド添加によって抑制したところ、コケイン症候群細胞の原因遺伝子mRNA量は回復が観察されたが、愚者細胞で発現低下が確認された遺伝子の回復は認められなかった。また、Western blottingにより蛋白質量を測定した結果、コケイン症候群細胞においてmRNAが消失していることが確認された遺伝子の蛋白質量は、コントロールのHeLa細胞と比較して有意に減少していた。この発現消失は細胞の種類によって度合いが異なるため、今後更に機構の解明を行っていくとともに発症との関連を検討していきたい。さらに、発現遺伝子のノックアウト法の構築を目指してDNA損傷修復関連遺伝子のRNAi誘導ベクターによるノックアウト系の構築を目指した。U6プロモーター下流にショートヘアピン型2本鎖RNAを発現できる配列を挿入し、培養細胞へ導入したところ標的mRNA量の特異的な減少が観察された。さらに誘導コンストラクトの改良やアデノウイルスによるRNAi誘導配列の導入法を取り入れて実験系を改善して行く予定である。

Biological UV rays, radiation, chemicals, and other important causes, metabolites, DNA damage, biological protection, information, correct next generation DNA damage, DNA repair system, and evolutionary process. Autosomal genetic disorders in patients with ovarian syndrome are caused by abnormal DNA repair mechanisms in cells, especially in cells, and in normal cells. The purpose of this study is to analyze the function of the causative factors, the expression of various genes, and the expression of proteins. Results: Quantitative RT-PCR method was used to compare HeLa cells with those of HeLa syndrome cells and to confirm the decrease in mRNA levels of specific genes. The causative gene of KDS cells was found to be different from that of normal cells, and the different mRNA was found to be different from that of normal cells. The expression of mRNA in these selected cells was detected and confirmed by the presence of an additional inhibitor, the presence of an inhibitor, and the presence of an inhibitor. The protein content of HeLa cells was determined by Western blotting. The mRNA content of HeLa cells disappeared. The protein content of HeLa cells was determined by Western blotting. The discovery of the missing cell species is a matter of course, and the future of the missing cell species is a matter of course. In addition, the construction of DNA damage repair-related RNAi induction gene system is also proposed. A specific decrease in the amount of U6-derived mRNA was observed when U6-derived RNA was introduced into cultured cells. The introduction of RNAi induced alignment into the induction system is an improvement of the induction system.