蛋白質の大量発現で形成される封入体の固体核磁気共鳴法による構造解析

使用固态核磁共振对大规模蛋白质表达形成的包涵体进行结构分析

• 批准号: 14780502
• 负责人: 梅津 光央
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14780502/
• 关键词: 封入体; 蛋白質発現; 蛋白質巻き戻し; 固体NMR; 蛋白質可溶化

昨年度は、ニワトリ卵白リゾチーム(HEL)を特異的に認識する抗体HyHEL10の一本鎖Fv断片(HyHEL10-scFv)が形成する封入体の構造解析を中心に行ってきたが、今年度は超好熱古細菌Pyrococcus horikohii OT3由来蛋白質の大腸菌発現で得られる封入体の構造解析とその構造を利用した巻き戻し法の開発を行った。まず、超耐熱性蛋白質が形成する不溶性顆粒のFT-IRスペクトルを測定したところ、他のものとは異なり非常に天然型構造と類似した二次構造を形成していることがわかった。さらに、二次元固体NMR法からValやAlaのCβ・Cγ化学シフト値を求めたところ、天然型と類似したαヘリックスの存在も確認され、超耐熱性蛋白質の二次構造は大腸菌内の発現で非常に速い時期に二次構造が形成されていることが示唆された(梅津他,FEBS Letters 557,49-56(2004))。次に、超耐熱性蛋白質に関して、不溶性顆粒中の構造を考慮した蛋白質再活性を試みたた。まず、不溶性顆粒の構造を変性させないで可溶化する方法として低濃度のカオトロピック剤を用いた。その結果、2Mグアニジン溶液で目的蛋白質は構造を保ちながら可溶化することがわかった。そして、そこから、アルギニン溶液を介してグアニジンを透析により除去していくと、高効率で蛋白質は天然型へ巻き戻り、耐熱性を示した。さらに、この手法を緑色蛍光蛋白質にも応用したところ、2Mグアニジン溶液ではなく2Mアルギニン溶液を用いることによって、天然型と同じ活性を持つ巻き戻りタンパク質が速やかに形成された。(津本,梅津他,Biochemical Biophysical Research Communications 312,1383-1386(2003))。以上から、不溶性顆粒中でも発現蛋白質はある程度天然型構造を形成しており、その構造を利用した蛋白質再活性法は十分可能であり、従来の手法よりも非常に簡便になることを示すことができた。

Yesterday annual は, ニ ワ ト リ albumen リ ゾ チ ー ム (HEL) を specific に know す る antibody HyHEL10 の a lock Fv fragment (HyHEL10 - scFv) が form す る の seal in body structure を center line に っ て き た が, our は "super hot archaea Pyrococcus horikohii OT3 origin protein の coliform 発 で must now ら れ る の seal in body structure と そ の constructing を using し た 巻 き 戻 し method の open 発 を line っ た. ま ず, super heat resistant protein が form す る insoluble particles の FT - IR ス ペ ク ト ル を determination し た と こ ろ, he の も の と は different な り very に natural type structure と similar し た formation し secondary tectonic を て い る こ と が わ か っ た. さ ら に, two dimensional solid NMR method か ら Val や Ala の C beta, c. gamma chemical シ フ ト numerical を o め た と こ ろ type, natural と similar し た alpha ヘ リ ッ ク ス の exist も confirm さ れ の, super heat resistant protein secondary structure は coliform in の 発 で now very に speed い period に formation さ secondary tectonic が れ て い る こ と が in stopping さ れ た (was he, F EBS Letters 557,49-56(2004). The に, superheat-resistant protein に is related to <s:1> て, the <s:1> structure in insoluble particles を is considered, and the reactivity of <s:1> た protein を is tested みたた. ま ず, insoluble particles の tectonic を - sex さ せ な い can で す melting method る と し て low concentration の カ オ ト ロ ピ ッ ク tonic を い た. Youdaoplaceholder0 <s:1> result, 2Mグアニジ <s:1> solution で target protein <s:1> structure を retention ちながら soluble する する とがわ った った そ し て, そ こ か ら, ア ル ギ ニ を ン solution interfaces し て グ ア ニ ジ ン を dialysis に よ り remove し て い く と type, high rate of unseen で protein は natural へ 巻 き 戻 り, heat resistant を し た. さ ら に, こ の gimmick を 蛍 green light protein に も 応 with し た と こ ろ, 2 m グ ア ニ ジ ン solution で は な く 2 m ア ル ギ ニ を ン solution with い る こ と に よ っ て, natural type と じ with active を つ 巻 き 戻 り タ ン パ ク mass が や か に form さ れ た. (Tsumoto, Umeda,Biochemical Biophysical Research Communications 312,1383-1386(2003)). Above か ら, insoluble particles in で も 発 now protein は あ る degree of natural type structure を form し て お り, そ の constructing を using し た は protein and active process very possible で あ り, 従 to の よ り も very easy に に な る こ と を shown す こ と が で き た.

项目成果

K.Tsumoto, M.Umetsu, et al.: "Immobilized oxidoreductase as an additive for refolding inclusion bodies : application to antibody fragments"Protein Engineering. 16. 535-541 (2003)

K.Tsumoto、M.Umetsu 等人：“固定化氧化还原酶作为重折叠包涵体的添加剂：应用于抗体片段”蛋白质工程。

M.Umetsu, et al.: "Magic-Angle Spinning NMR under ultra-high field reveals two forms of intermolecular interaction within CH_2Cl_2-treated (3^1R)-type bacteriochlorophyll c solid aggregate"The Journal of Physical Chemistry B. 108. 2726-2734 (2004)

M.Umetsu 等人：“超高场下的魔角旋转核磁共振揭示了 CH_2Cl_2 处理的 (3^1R) 型细菌叶绿素 c 固体聚集体中分子间相互作用的两种形式”The Journal of Physical Chemistry B. 108。

M.Umetsu, et al.: "Dynamic Exchange Properties of the Antiparallel Bacteriochlorophyll c dimers"The Journal of Physical Chemistry B. 107. 9876-9882 (2003)

M.Umetsu 等：“反平行细菌叶绿素 c 二聚体的动态交换特性”物理化学杂志 B.107.9876-9882 (2003)