生殖腺凍結保存による配偶子回収に関する病理学的・免疫学的検討

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我々が目標とする性腺凍結のためにまず、性腺を休止状態に導入することが有利であると考えた。そこで我々は安価にGnRHを抑制し、性腺を抑制するためのDNAワクチンを考案した。GnRHをタンデムに5回繰り返し、その間にヒンジ構造を有する人工遺伝子をプライマー伸長法を用い作成して得た、約100~180bpの2本鎖DNAをT4ライゲースで結合し、pBluescriptに組み込んだ塩基配列を確認ののち、この約500bpのcDNAを発現ベクターpcDNA3に組み込み、GnRH DNAワクチンを作成した。これをまず、COS-7細胞に導入すると抗GnRH抗体に反応するたんぱく質の発現を細胞内および培養上清中にみとめた。続いてこのプラスミドを成熟オスマウスの大腿四頭筋に筋肉注射を行った。2〜4週間毎に連続して投与し、免疫反応を抗GnRH抗体価をアルブミンを結合したGnRHペプチドを用いたELISAプレートを作成し、これを用いて検討した。また、プラスミドの発現と免疫反応の強化のために生体内に効率よく遺伝子導入を行うことができるHVJ-Eベクターを用いて、GnRH DNAワクチンを投与した。Vehicle群、GnRH DNAワクチン投与群、HVJ-E-GnRH DNAワクチン投与群でそれぞれの抗GnRH抗体価をELISAの吸光度で比較すると、HVJ-E-GnRH DNAワクチンでもっとも高い抗体価の誘導が認められた。現在、このGnRH DNAワクチン12週間投与後の性腺の形態、造精機能、性行動への影響について検討・解析を進めている。