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ATPアナログ認識可能な変異型MAPキナーゼを利用した新規リン酸化基質の探索

使用可识别 ATP 类似物的突变 MAP 激酶寻找新的磷酸化底物

基本信息

批准号：
04J11176
负责人：
北川大樹
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J11176/
关键词：
JNK SAPK 変異型キナーゼ標的基質 ATPアナログ

项目摘要

哺乳類動物細胞には細胞増殖や癌化に関与するMAPキナーゼ(ERK)に加え、ストレス応答性MAPキナーゼであるJNK/SAPK及びp38が存在し、様々なストレス刺激に応答し、アポトーシス誘導や生存維持に深く関与することが知られている。しかしながら、これらのMAPキナーゼが各局面においてどの様な分子のリン酸化を通じて生理現象を制御しているかは不明のままである。そこで、1)MAPキナーゼファミリーの標的分子を同定するための新規スクリーニング法を開発すること、2)固有の現象におけるMAPキナーゼの標的基質を解明することにより、MAPキナーゼ活性化の生理的意義を明確にすることを目的として研究を進めた。一般に細胞抽出液内に存在するキナーゼの標的分子を同定することは困難な場合が多い。その原因の一つは、共存する多種多様のキナーゼが一斉にリン酸化反応を行い、目的のリン酸化反応を覆い隠してしまうことにある。そこで、アイソトープラベルされた非天然型ATPアナログ([γ-^<32>P]-N^6-cyclohexyl ATP)の合成と、これをリン酸化反応の基質として利用可能な点変異キナーゼを作製することによって、変異キナーゼだけが標的分子にアイソトープラベルされたγ位のリン酸基を転移できるような実験系の開発を行った。放射標識したATPアナログはN^6-cyclohexyl adenosineを出発材料に、有機合成後に酵素反応を利用して調製した。また、3次元X線構造解析の結果をもとにしたキナーゼ分子内のATPポケットの解析から、点変異JNK/SAPKを作製した。JNK/SAPKの基質として知られるGST-c-Junのリン酸化能を指標に、活性化された野生型もしくは変異型JNK/SAPKがATPアナログを利用可能かどうか検討したところ、変異型JNK/SAPKのみが利用可能であった。この結果からATPアナログを認識できるのは変異型キナーゼのみであることが示され、この実験系の妥当性を確認することができた。さらに、実際にこの実験系を用いてマウス肝臓核画分中から40-50kDa付近に分子量を持つJNK/SAPKのリン酸化基質を3分子検出することに成功している。現在、これらの分子のマウス肝臓核画分からの精製が進行中である。さらに、無細胞系に変異型キナーゼとATPアナログを導入することによる、リン酸化標的基質の新規探索法の確立も同時に進行中である。

Mammalian cell proliferation and carcinogenesis related to MAP (ERK), increase in response to MAP (JNK/SAPK) and p38, the existence of, response to, induction of, and maintenance of survival related to. The MAP of each situation is controlled by a physiological phenomenon. 1) The identification of target molecules of MAP, 2) The development of new methods of MAP, 3) The elucidation of intrinsic phenomena, 4) The elucidation of target molecules of MAP, 5) The elucidation of physiological significance of MAP activation. In general, there are many cases where the target molecules are present in the cell extract. A variety of reasons for this, co-existence, and a variety of reasons for this, and a variety of reasons for this. The synthesis of non-natural ATP ([γ-^<32>P]-N^6-cyclohexyl ATP) and the development of a novel system using a matrix that can be used for the preparation of target molecules are described below. Radiolabelling ATP is a new method for the production of N^6-cyclohexyl adenosine and the use of enzymes after organic synthesis. 3-D X-ray structural analysis results are analyzed by ATP and JNK/SAPK in molecular structure. JNK/SAPK matrix is known to be a GST-c-Jun indicator of activity, activity, and wild-type JNK/SAPK. ATP is not available. JNK/SAPK is available. This result shows that there is no doubt about the importance of understanding the ATP protocol and confirms the appropriateness of this practical system. In addition, in practice, this system has been successfully used in the production of three molecules from JNK/SAPK and its acidulated matrix in the range of 40-50kDa. Now, we are in the process of refining the molecules. In addition, the establishment of a new method for exploring the target substrate for the introduction of ATP into a cell-free cell line is ongoing.