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ナルコレプシー視床下部におけるオレキシン転写制御因子の研究

发作性睡病下丘脑食欲素转录调节因子的研究

基本信息

批准号：
17700362
负责人：
田中進
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17700362/
关键词：
オレキシンナルコレプシー転写制御自己免疫プロモーター

项目摘要

前年度成人視床下部及びヒトfetal brain cDNAライブラリーを用いOne-hybridにより同定したタンパクが含まれるベクターを酵母から抽出し大腸菌に形質転換し直した後、精製した。同定したタンパクはpGADT7-Rec2ベクターに組み込まれている為、in vitro転写翻訳システムによってHA融合組み替えタンパクの形で発現させることが可能である。in vitro転写翻訳システムによって発現させたタンパクとオレキシンプロモーター57bpとを反応させた後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った<Electro Mobility Shift Assay (EMSA)>>。核酸であるオレキシンプロモーター57bpはSYBR Green、融合タンパクはSYPRO Rubyによって染色後、UV照射によるバンドの位置確認を行った。結果としてOne-hybridでの陽性クローン全てに関してEMSAではプロモーター配列の移動は見られなかった。抗HA抗体を用いたWestern blottingによって融合タンパクの発現は確認出来た。確認としてキットに添付のp53結合配列と組み替えp53を用いて同様にEMSAを行った結果、バンドの移動を確認した。抗HA抗体存在下でのsuper shiftも検出した。感度はEMSAが高いとされており、真のクローンをOne-hybridで同定しているならEMSAによるバンドの移動が確認出来るはずである。即ち、前年度に同定した全ての陽性クローンが非特異であったと考えられる。非特異な反応を抑える為200mM 3-ATにて陽性クローンを得たが、EMSAにおいては陰性であった。そこで、1)最小プロモーターとして同定されている57bpでも余分な箇所を含むと2)1コピーで行っている為、パワー不足でスクリーニングした数が少なすぎる(成人視床下部で112万個、ヒトfetal brainで80万個クローンをスクリーニング済み)可能性が考えられる。今後の検討課題として、57bpを数コピー連結することは現実的ではなく10bp程度を4コピー以上連結しOne-hybridを行う事が望ましいと考えられる。もう一つの可能性としてタンパク複合体が結合に必要である為、One-hybridシステムでは拾えない可能性も考えられた。

In the past year, the lower part of the adult optic bed and the fetal brain cDNA were used in one-hybrid culture. The same is true for pGADT 7-Rec 2. In vitro, the HA fusion group is likely to occur. In vitro, the "Electro Mobility Shift Assay (EMSA)" was developed by the "Electro Mobility Shift Assay"(EMSA). The nucleic acid sequence is 57 bp in length, SYBR Green in length, SYPRO Ruby in length, UV in length, and SYBR Green in length. As a result, the one-hybrid system has been fully integrated into the EMSA system, and the one-hybrid system has been fully integrated into the EMSA. Anti-HA antibodies were identified by Western blotting. Confirm that the p53 is added and the p53 is replaced by the EMSA. In the presence of anti-HA antibody, super shift occurs. EMSA sensitivity is high, true, one-hybrid, constant, EMSA sensitivity is high, true, one-hybrid, one-hybrid, constant, one-hybrid, one-hybrid, one- That is, the previous year, the same time, the same time. Non-specific anti-inflammatory drugs are 200 mM 3-AT, EMSA, and negative. 1) The minimum number of cells is 57 bp; 2) The minimum number of cells is 1.12 million in the lower part of the adult optic bed; 8) The number of cells is 800,000 in the fetal brain; and 3) The minimum number of cells is 57 bp. Future research topics include: 57 bp and more links; 10 bp and more links; One-hybrid and more links. The possibility of one-hybrid complex is necessary for one-hybrid complex.