ナルコレプシー視床下部におけるオレキシン転写制御因子の研究

发作性睡病下丘脑食欲素转录调节因子的研究

• 批准号: 17700362
• 负责人: 田中 進
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17700362/
• 关键词: オレキシン; ナルコレプシー; 転写制御; 自己免疫; プロモーター

前年度成人視床下部及びヒトfetal brain cDNAライブラリーを用いOne-hybridにより同定したタンパクが含まれるベクターを酵母から抽出し大腸菌に形質転換し直した後、精製した。同定したタンパクはpGADT7-Rec2ベクターに組み込まれている為、in vitro転写翻訳システムによってHA融合組み替えタンパクの形で発現させることが可能である。in vitro転写翻訳システムによって発現させたタンパクとオレキシンプロモーター57bpとを反応させた後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った<Electro Mobility Shift Assay (EMSA)>>。核酸であるオレキシンプロモーター57bpはSYBR Green、融合タンパクはSYPRO Rubyによって染色後、UV照射によるバンドの位置確認を行った。結果としてOne-hybridでの陽性クローン全てに関してEMSAではプロモーター配列の移動は見られなかった。抗HA抗体を用いたWestern blottingによって融合タンパクの発現は確認出来た。確認としてキットに添付のp53結合配列と組み替えp53を用いて同様にEMSAを行った結果、バンドの移動を確認した。抗HA抗体存在下でのsuper shiftも検出した。感度はEMSAが高いとされており、真のクローンをOne-hybridで同定しているならEMSAによるバンドの移動が確認出来るはずである。即ち、前年度に同定した全ての陽性クローンが非特異であったと考えられる。非特異な反応を抑える為200mM 3-ATにて陽性クローンを得たが、EMSAにおいては陰性であった。そこで、1)最小プロモーターとして同定されている57bpでも余分な箇所を含むと2)1コピーで行っている為、パワー不足でスクリーニングした数が少なすぎる(成人視床下部で112万個、ヒトfetal brainで80万個クローンをスクリーニング済み)可能性が考えられる。今後の検討課題として、57bpを数コピー連結することは現実的ではなく10bp程度を4コピー以上連結しOne-hybridを行う事が望ましいと考えられる。もう一つの可能性としてタンパク複合体が結合に必要である為、One-hybridシステムでは拾えない可能性も考えられた。

Before the annual adult depending on the lower part of the bed and び ヒ ト fetal brain cDNA ラ イ ブ ラ リ ー を with い One - hybrid に よ り with fixed し た タ ン パ ク が containing ま れ る ベ ク タ ー を yeast か ら spare し coliform に form quality planning in し straight し た, refined し た. With fixed し た タ ン パ ク は pGADT7 - Rec2 ベ ク タ ー に group み 込 ま れ て い る for, in vitro planning write turn 訳 シ ス テ ム に よ っ て み HA fusion group for え タ ン パ ク の form で 発 now さ せ る こ と が may で あ る. The in vitro planning write turn 訳 シ ス テ ム に よ っ て 発 now さ せ た タ ン パ ク と オ レ キ シ ン プ ロ モ ー タ ー 57 bp と を anti 応 さ せ た, ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル electric line 気 swimming を っ た < company Mobility Shift Assay (EMSA) > >. Nucleic acid で あ る オ レ キ シ ン プ ロ モ ー タ ー 57 bp は SYBR Green, fusion タ ン パ ク は SYPRO Ruby に よ っ て after dyeing, UV irradiation に よ る バ ン ド の line position confirmation を っ た. Positive results と し て One - hybrid で の ク ロ ー ン full て に masato し て EMSA で は プ ロ モ ー タ ー match column の mobile は see ら れ な か っ た. Anti-ha antibodies を were identified by を たWestern blottingによって fusion タ <s:1> パ パ and confirmed by た. Confirm と し て キ ッ ト に add pay の p53 combined with column group と み for え p53 を with い て with others に EMSA を line っ た results, バ ン ド の mobile を confirm し た. In the presence of anti-ha antibodies, で <s:1> super shift で 検 produces た. High sensitivity は EMSA が い と さ れ て お り, true の ク ロ ー ン を One - hybrid で with fixed し て い る な ら EMSA に よ る バ ン ド の mobile が identified る は ず で あ る. That is, ち and the previous year に are both determined to be <s:1> た all て <s:1> positive, <s:1> ロ <s:1> が が が が が が non-specific であったと to test えられる. Nonspecific な anti 応 を え suppression る for 200 mm 3 - AT に て positive ク ロ ー ン を must た が, EMSA に お い て は negative で あ っ た. そ こ で, 1) minimum プ ロ モ ー タ ー と し て with fixed さ れ て い る 57 bp で も yu points な を include む と 2) 1 コ ピ ー で line っ て い る for, パ ワ ー insufficient で ス ク リ ー ニ ン グ し た number less が な す ぎ る (1.12 million, adults see bed bottom で ヒ ト fetal Brian で 800000 ク ロ ー ン を ス ク リ ー ニ ン グ 済 み) possibility が exam え ら れ る. Future の 検 for subject と し て, 57 bp を コ ピ ー link す る こ と は presently be で は な く 10 degree bp を 4 コ ピ ー the above link し One - hybrid を doeth う が hope ま し い と exam え ら れ る. も う a つ の possibility と し て タ ン パ ク complex が combining に necessary で あ る, One - hybrid シ ス テ ム で は pick え な い possibility も exam え ら れ た.

项目成果

Detection of autoantibodies against hypocretin, hcrtrl, and hcrtr2 in narcolepsy : anti-Hcrt system antibody in narcolepsy.

检测发作性睡病中针对下丘脑分泌素、hcrtrl 和 hcrtr2 的自身抗体：发作性睡病中的抗 Hcrt 系统抗体。

• 发表时间: 2006
• 期刊: Sleep 29巻
• 作者: Tanaka S;Honda Y;Inoue Y;Honda M
• 通讯作者: Honda M

Detection by radioligand assay of antibodies against Borna disease virus in patients with various psychiatric disorders

• DOI: 10.1128/cdli.12.5.671-676.2005
• 发表时间: 2005-05-01
• 期刊: CLINICAL AND DIAGNOSTIC LABORATORY IMMUNOLOGY
• 作者: Matsunaga, H;Tanaka, S;Amino, N
• 通讯作者: Amino, N