無保護でのペプチド合成のための新規ペプチド合成酵素の探索と開発

用于无保护肽合成的新型肽合成酶的搜索和开发

• 批准号: 22380053
• 负责人: 横関 健三
• 金额: $ 11.32万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2010
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2010-04-01 至 2013-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22380053/
• 关键词: ジペプチド; βペプチド; L-アミノ酸メチルエステル; オリゴペプチド; ペプチド

ペプチドには有用な生理活性あるいは新たな物性を示すものが数多く知られており、ペプチドの機能性解明や生産法開発に関する研究が盛んに行われている。これまで申請者のグループではアミノ酸メチルエステル体をアシル供与体、アミノ酸を求核剤としてペプチド合成反応に使用できる新規酵素を発見し、短時間で効率のよい新しいペプチド生産法を確立している。この酵素は広い基質特異性を示す一方、唯一プロリンだけは求核剤として認識されにくいという課題があった。本研究ではプロリンを求核剤として効率良く利用できる新規酵素の探索を行った。まず本研究室保存菌697株を対象に、アラニンメチルエステルとプロリンからアラニン-プロリンペプチドを生成する微生物の探索を実施した。この結果15株においてアラニン-プロリンペプチドの蓄積が確認された。最も生成活性の高かった微生物はStreptomyces sp.AKU2711株であり、この菌株の無細胞抽出液におけるアラニン-プロリンペプチド生成活性は10,8mU/mgという比較的高い活性を示した。次いで自然界からアラニン-プロリンペプチド合成活性を保持する微生物の単離を行った。アセチルプロリンやアラニン-プロリンペプチドを単一炭素源として利用できる微生物を約300株土壌より分離できた。この微生物の内、6株において高いアラニン-プロリンペプチド生成活性を確認でき、中でも1株についてはAKU2711株の2倍の活性を保持していることを明らかにできた。以上の様にプロリンを含むあらゆるペプチドの合成を可能とするシステムの構築の目処が立ったため、さらに新規機能性ペプチド開発の原料としての利用を念頭に置いた水酸化アミノ酸の生産法の開発を実施した。アミノ酸水酸化酵素であるジオキシゲナーゼ類の基質特異性解析と反応産物の構造解析を行ったところ、分岐鎖アミノ酸に対して広い水酸化活性を保持していることを明らかにできた。

ペ プ チ ド に は useful な physiological activity あ る い は new た な property を shown す も の が more く know ら れ て お り, ペ プ チ ド の functional interpret や production method open 発 に masato す る research が sheng ん に line わ れ て い る. こ れ ま で applicants の グ ル ー プ で は ア ミ ノ acid メ チ ル エ ス テ ル body を ア シ ル with body and ア ミ ノ nuclear acid を o tonic と し て ペ プ チ ド synthetic anti 応 に use で き る new rules enzyme を で 発 し, a short time working rate の よ new し い い ペ プ チ ド を production method to establish し て い る. こ の enzyme は hiroo い substrate specificity を す in one party, the only プ ロ リ ン だ け は one of the core と し て know さ れ に く い と い う subject が あ っ た. This study で は プ ロ リ ン を one of the core と し て sharper rate good く using で き る の explore new rules enzyme を line っ た. ま ず we save the fungus 697 strains を に, seaborne ア ラ ニ ン メ チ ル エ ス テ ル と プ ロ リ ン か ら ア ラ ニ ン - プ ロ リ ン ペ プ チ ド を generated す る microbial の explore を be applied し た. <s:1> <s:1> results: 15 strains にお にお てアラニ プロリ プロリ プロリ ペプチド が accumulation が confirmation された. Most も generate high active の か っ た microbial は Streptomyces sp. AKU2711 strains で あ り, こ の strains の cell-free extract に お け る ア ラ ニ ン - プ ロ リ ン ペ プ チ ド generated active は 10, 8 mU/mg と い う comparison of high い activity を shown し た. Time い で nature か ら ア ラ ニ ン - プ ロ リ ン ペ プ チ ド synthetic activity was を す る microbial の 単 line from を っ た. ア セ チ ル プ ロ リ ン や ア ラ ニ ン - プ ロ リ ン ペ プ チ ド を 単 a carbon source と し て using で き る microbial を about 300 strains of soil 壌 よ り separation で き た. こ の microbes, 6 strains within の に お い て high い ア ラ ニ ン - プ ロ リ ン ペ プ チ ド generated active を confirm で き, medium で も 1 strain に つ い て は AKU2711 strains の 2 times の activity was を し て い る こ と を Ming ら か に で き た. の above others in に プ ロ リ ン を containing む あ ら ゆ る ペ プ チ ド の synthetic を may と す る シ ス テ ム の build の mesh 処 が made っ た た め, さ ら に new rules on functional ペ プ チ ド open 発 の materials と し て の with を thought に buy い た water acidification ア ミ ノ acid の production の open 発 を be applied し た. ア ミ ノ acid acidification enzyme で あ る ジ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ class の substrate specificity の と anti 応 product structure parsing line を っ た と こ ろ, branching lock ア ミ ノ acid に し seaborne て hiroo い water acidification active を keep し て い る こ と を Ming ら か に で き た.

项目成果

A novel 1-isoleucine metabolism in Bacillus thuringiensis generating (2S, 3 R, 4 S)-4-hydroxyisoleucine, a potential insulinotropic and anti-obesity amino acid

苏云金芽孢杆菌中新型 1-异亮氨酸代谢产生 (2S, 3 R, 4 S)-4-羟基异亮氨酸，这是一种潜在的促胰岛素和抗肥胖氨基酸

• 发表时间: 2010
• 期刊: Applied Microbiology and Biotechnology
• 影响因子: 5
• 作者: Ogawa;J.;T.Kodera;S.V.Smirnov;M.Hibi;N.N.Samsonova;R.Koyama;H.Yamanaka;J.Mano;T.Kawashima;K.Yokozeki;S.Shimizu
• 通讯作者: S.Shimizu

酵素利用技術大系(小宮山眞監修)第7編-第1章-第2節(5.新規酵素を用いるオリゴペプチド工業新製法の開発)

酶利用技术体系（小宫山诚监修）第7卷第1章第2节（5.使用新酶开发寡肽工业的新制造方法）

• 发表时间: 2010
• 作者: 清水健太郎;他;横関健三
• 通讯作者: 横関健三

Metabolic engineering of Escherichia coli to produce (2S, 3R, 4S)-4-hydroxyisoleucine

• DOI: 10.1007/s00253-010-2772-3
• 发表时间: 2010-10-01
• 期刊: APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY
• 影响因子: 5
• 作者: Smirnov, Sergey V.;Kodera, Tomohiro;Shimizu, Sakayu
• 通讯作者: Shimizu, Sakayu

アミノ基修飾酵素と水酸化酵素を共役させたβ-ヒドロキシアミノ酸生産系の開発

开发结合氨基修饰酶和羟化酶的β-羟基氨基酸生产系统

• 发表时间: 2012
• 作者: 日比慎;笠原拓也;河嶋隆志;横関健三;清水昌;小川順
• 通讯作者: 小川順

α-ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼを利用した有用アミノ酸の立体選択的生産

使用 α-酮戊二酸依赖性双加氧酶立体选择性生产有用氨基酸

• 发表时间: 2011
• 作者: 日比慎;河嶋隆志;清水昌;横関健三;小川順
• 通讯作者: 小川順