Molekulare und biochemische Charakterisierung der Alginat-Polymerase aus Pseudomonas aeruginosa

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Im Rahmen des Vorhabens soll die Alginat-Polymerase, das Schlüsselenzym der Alginat-Biosynthese, aus Pseudomonas aeruginosa identifiziert, gereinigt und molekular charakterisiert werden. Zunächst soll ein empfindliches Enzymassay für die Alginat-Polymerase entwickelt werden, welches die Reinigung des nativen Enzyms ermöglichen soll. Das gereinigte Enzym soll biochemisch und enzymologisch charakterisiert werden. Es wurden bereits Gene (alg8, alg44, algK, algX) im Alginat-BiosyntheseGen-Cluster identifiziert, deren Genprodukte vermutlich die Alginat-Polymerase in der Cytoplasmamembran rekonstituieren. Diese Gene sollen in Escherichia coli, Pseudomonaden und isogenen Alginat-negativen Mutanten von P. aeruginosa, die kein Alginat bilden, funktionell exprimiert werden. Dies soll sowohl Hinweise auf die Funktion der Genprodukte als essentielle Untereinheiten der Alginat-Polymerase liefern als auch die Reinigung dieses Enzyms erleichtern. Zusätzlich soll die Reinigung der nativen Alginat-Polymerase aus Alginat-überproduzierenden Mutanten von P. aeruginosa vorgenommen werden und die Untereinheiten identifiziert werden. Die Etablierung eines empfindlichen Enzymassays und die Verfügbarkeit gereinigter Alginat-Polymerase würde zum einen die in vitro Synthese von definierten Alginatmolekülen erlauben und zum anderen das Screening nach Inhibitoren ermöglichen, die die Entwicklung von Biofilmen verhindern würden. Die Funktion der Alginat-Biosynthese bei der Überdauerung differenzierter Biofilme soll evaluiert werden. Durch heterologe Expression von Alginat-Biosynthesegenen soll ebenso die Biosynthese definierter Alginate, die als biokompatible Materialien für vielfältige medizinische Anwendungen eingesetzt werden können, ermöglicht werden.