濃縮された遺伝子発現セットのリポソーム封入による生命システム再構成条件の探索

通过脂质体封装富集的基因表达集来寻找重建生命系统的条件

• 批准号: 11J03718
• 负责人: 藤原 慶
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 2013
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J03718/
• 关键词: 細胞再構成; 無細胞翻訳; セントラルドグマ; 人工細胞; 再構成; 細胞抽出液; タンパク質安定性

本研究の目的である「物質からの細胞再構成」のための道筋理解に向けて、以下の2つの成果を上げた。1. 試験管内でのセントラルドグマサイクルの再構築生命の自己複製はDNA複製、転写、翻訳といったセントラルドグマの流れが繰り返されること(セントラルドグマサイクル)により成り立つが、この過程を試験管内で再現した。転写と翻訳に必須の因子のみからなるが、DNA複製系をもたないPURE systemを用い、大腸菌のDNA複製系を発現させた。昨年までに見出した、DNA複製に関与する13遺伝子を機能的に発現できる条件を活用し、本年度はこれら13の因子が共同的に働くことを確認した。結果、27℃ 1晩の発現を行った場合、同時に発現したタンパク質群も発現後に共同してDNA複製を行うことが示された。さらに、特殊な遺伝子回路を設計により、試験管内でセントラルドグマサイクルが回ることを実証した。2. 細胞内と同等の成分を持つ人工脂質二重膜小胞の構築と解析生命を細胞抽出液から再構成するための手段を明らかにするため、昨年度までに調製に成功した無添加細胞抽出液(AFCE)を、細胞同様に脂質二重膜小胞(リポソーム)に内包する手法を開発した。昨年度までに、リポソームの半透膜的性質を用いて、外部浸透圧と内部浸透圧の差により内部高分子の濃縮可能性を示していた。そこで本年度は、より定量的な解析と、単成分タンパク質であるBSAを内在させたリポソーム(BSAリポソーム)とAFCEリポソームの違いを解析した。BSAリポソームは理論と同様、最初に与える外部浸透圧と内部浸透圧の比により最終的なリポソーム内の高分子濃度が決定されたが、本手法でAFCEを濃縮した場合、生体高分子濃度300mg/mL近傍で濃縮が停止する現象が見られた。同時に、余剰膜はBSAリポソームと異なるチューブ状変形を提示することを見出した。これらの結果により、単成分であるBSAと多成分であるAFCEでは本質的に内部パラメーターが異なることを示した。

The goal of this study is to understand the relationship between material and cellular reconstruction, and to achieve the following results. 1. The process of DNA replication, transcription, translation, and reproduction in the tube is reproduced in the tube. The DNA replication system was developed in E. coli. Last year, we found out that DNA replication is related to the development of 13 gene functions. This year, we confirmed the common development of 13 gene functions. The results showed that DNA replication occurred at 27℃ 1 night after DNA replication occurred. In addition, special transmission sub-circuits are designed and tested in the tube. 2. The construction of artificial lipid double membrane vesicles, the analysis of life, the reconstitution of cell extract, and the development of methods for the successful modulation of intracellular components without the addition of cell extract (AFCE) and cell lipid double membrane vesicles. The properties of semipermeable membranes, the difference between external and internal permeation pressures, and the possibility of concentration of internal polymers were demonstrated. This year, the quantitative analysis and analysis of BSA and AFCE are carried out. BSA is concentrated in the vicinity of 300mg/mL. At the same time, the remaining film BSA is different from the shape of the tip. The result of this is that BSA and AFCE are different from each other.

项目成果

細胞内に近い高分子濃度を持つ無添加細胞抽出液の調製とその解析

聚合物浓度接近细胞内浓度的无添加剂细胞提取物的制备和分析

• 发表时间: 2013
• 作者: 藤原慶;柳澤実穂;野村M.慎一郎
• 通讯作者: 野村M.慎一郎

YACを見据えた「物質からの細胞再構成に必要な条件の探索」

着眼于YAC“从材料中寻找细胞重构所需的条件”

• 发表时间: 2012
• 作者: M. Shimizu;F. Iguchi and H. Yugami;藤原慶
• 通讯作者: 藤原慶

A bacterial ion-sensing device without electrodes.

一种没有电极的细菌离子传感装置。

• 发表时间: 2011
• 作者: Fujiwara Kei;Aoi Keita;Nomura M. Shin-ichiro
• 通讯作者: Nomura M. Shin-ichiro

再構成無細胞翻訳系を用いたゲノム型DNA複製システムの発現

使用重构的无细胞翻译系统表达基因组 DNA 复制系统

• 发表时间: 2013
• 作者: 藤原 慶;片山 勉;野村M. 慎一郎
• 通讯作者: 野村M. 慎一郎

Microrheology study of crowding effects on cell mechanics

细胞力学拥挤效应的微流变学研究

• 发表时间: 2013
• 作者: 水野大介1;Villaruz Lara 1,中益朗子1,池辺詠美1;Head David 2;Daisuke Mizuno;Daisuke Mizuno;西澤賢治,藤原慶,柳澤実穂,水野大介;西澤賢治,藤原慶,柳澤実穂,水野大介
• 通讯作者: 西澤賢治,藤原慶,柳澤実穂,水野大介