タンパク質リン酸化を選択的に認識する化学プローブの創製

创建选择性识别蛋白质磷酸化的化学探针

基本信息

批准号：
11J06795
负责人：
秋葉宏樹
金额：
$ 0.9万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2012
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究課題においては、Tb(III)錯体を利用して、タンパク質におけるチロシンリン酸化の直接可視化を目指した研究を行ってきた。当該年度においては、1.阻害剤の機能可視化による創薬への貢献を目指した展開、2.基質へのコンジュゲーションによる検出系の応用拡大、3.認識メカニズムの解明、という3点について研究を進めた。1.阻害剤の機能可視化前年度の段階においてチロシンキナーゼSrcの活性に対する阻害剤staurosporineの影響を可視化することに成功していたが、本年度においては幅広い酵素、阻害剤の組み合わせについてそれらを可視化し定量的に比較することに成功した。さらに、キナーゼと相補的に働くフォスファターゼの働き、フォスファターゼに対する阻害剤の効果をも可視化、定量することができた。既存の手法と比較してもよいシグナル/ノイズ比が得られることから、新規の阻害剤の評価系として発展させるうえで非常に有望な手法の1つであるといえる。2.コンジュゲーションによる検出系の拡大Huisgen環化付加反応によって基質にコンジュゲーションすることのできるTb(III)錯体Tb_2-Lclyneを合成した。基質ペプチドとしては、より反応観察に適切であるAbltideを用い、Ablによる反応を可視化することとした。コンジュゲーション反応とコンジュゲートペプチド精製の最適化を行ったところ、リン酸化反応に従って大幅に発光強度が増大する系を構築することに成功した。従来のTb_2-L^1では可視化できなかったターゲットも可視化できたことから、検出系の拡大に寄与する結果となった。3.認識メカニズムの解析リン酸化TyrのモデルであるPhOPと比較的強く相互作用するTb(III)複核錯体Tb_2-L^1を用い、エネルギー伝達効率を求めることで、フェノール部位とTb(III)イオンとの距離が7.64Åと決定された。これは、リン酸部位が2つのTb(III)イオンと、それぞれ水1分子を介して相互作用するモデルとよく一致する。このことから、Tb2-L1の2つのTb(III)イオンが協同的に作用することが示唆された。

在这个研究主题中，我们一直在进行旨在使用TB（III）配合物直接可视化蛋白质酪氨酸磷酸化的研究。在财政年度，我们对三个点进行了研究：1。开发旨在通过抑制剂的功能可视化来促进药物发现，2。通过偶联到底物扩展检测系统的应用，并揭示识别机制。 1。抑制剂在上一年的功能可视化，我们能够可视化抑制剂staurosporine对酪氨酸激酶SRC活性的影响，但是今年，我们能够可视化和定量比较广泛的酶和抑制剂组合。此外，还可以观察和量化与激酶作用的磷酸酶的作用以及抑制剂对磷酸酶的作用。由于它提供了可以与现有方法进行比较的信号/噪声比，因此可以说是开发新抑制剂评估系统的最有前途的方法之一。 2。通过共轭A TB（III）复合物TB_2-lclyne扩大检测系统，可以通过Huisgen Cyclization加法反应将其结合到底物。由于底物肽，更适合于观察反应的变速箱被用来可视化与ABL的反应。优化了共轭肽的共轭反应和纯化，我们能够根据磷酸化反应构建一个系统，其中发光强度显着增加。可以可视化无法使用常规TB_2-L^1可视化的目标，这有助于检测系统的扩展。 3。分析识别机制通过使用TB（iii）DINUCLIEAL复合物TB_2-L^1确定苯酚位点和TB（III）离子之间的距离为7.64Å，通过确定能量传递效率，，该核酸（III）与磷酸化的Tyr相互作用相对与磷酸化的Tyr相对强烈。这与磷酸盐位点与两个TB（III）离子相互作用的模型非常吻合，每个TB（III）通过单个水分子。这表明TB2-L1的两个TB（III）在合作中作用。