Adenoviral vermittelte RNA-Interferenz in Kardiomyozyten

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RNA Interferenz (RNAi) repräsentiert einen evolutionär konservierten Mechanismus, der den Abbau von mRNAs verursacht, welche homologe Nukleotidsequenzen zu kurzen (ca. 22 nt) doppelsträngigen RNAs (small interfering RNA, siRNA) aufweisen. Der genspezifische Abbau von mRNA mittels siRNA repräsentiert eine innovative Technik, durch die es möglich ist, eine Vielzahl von funktionellen Genomanalysen im Hinblick auf physiologische und pathophysiologische Fragen durchzuführen. In verschiedensten eukaryontischen Zelltypen konnte die genspezifische Zerstörung von mRNA mittels siRNA, nachgewiesen werden. Bisher nicht untersucht ist dieses System an postmitotischen Kardiomyozyten und Neuronen. Hauptziel des beantragten Vorhabens ist die Etablierung einer Methode zur Expression von siRNA zur gezielten Genausschaltung in adulten kardialen Myozyten. Da adulte Myozyten einem Gentransfer mit Hilfe nicht-viraler Vektoren nur schwer zugänglich sind, sollen die siRNA-Moleküle durch ein adenovirales System transkribiert werden. Dazu werden etablierte virale Vektoren so verändert, dass die siRNA Transkription über Promotoren erfolgt, welche die Expression von kurzen RNA Stücken unterstützen. Nach Demonstration der Machbarkeit am Beispiel eines targets mit einer definierten Funktion soll die Methode eingesetzt werden, um die Funktion von RGS-Proteinen in einem kurzen Signalweg zu untersuchen. Der Rückgang der jeweiligen mRNA wird über quantitative real-time PCR-Analysen bzw. bei Verfügbarkeit von Antikörpern auf Proteinebene verifiziert. Funktionelle Konsequenzen der verringerten Expression von RGS Proteinen werden mit Hilfe von Patch clamp Messungen des GIRK Stromes untersucht, dessen Aktivierung/Deaktivierung einen äußerst sensitiven online assay für kinetische Eigenschaften des G-Protein Zyklus der Gi/o-Klasse bieten.