超高分解能立体構造解析を目指した蛋白質結晶化方法の開発

开发用于超高分辨率三维结构分析的蛋白质结晶方法

• 批准号: 09878126
• 负责人: 三井 幸雄
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Nagaoka University of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09878126/
• 关键词: 結晶化; 精製; X線結晶構造解析; 蛋白結晶学; 蛋白構造

本研究においては、高精度な蛋白質のX線結晶構造解析に必要とされる良質の結晶を作成するための方法を幾つかのサンプル(BphB,BnzB,BphC,BphD,LigAB,EtbC等)を用いて検討した。1.蛋白質の純度と得られる結晶の関係の検討幾つかの蛋白質においては、サンプルとして使用する蛋白質の純度が不十分な場合でも結晶を得ることが可能である。しかしながら多くの場合、そのようなサンプルを用いて結晶化を行うと双晶が生じてしまう。本研究では、蛋白質サンプルの精製度を上げることで(具体的には、精製条件の再検討を行うことで)、双晶の生成をかなりの確立で抑制できることを示すことができた。具体的には、BnzB,BphDにおいて、精製条件を改良することにより、双晶の発生を押さえることに成功した。また、結晶化条件は同一でも精製条件を変えれば、サンプルの純度に大きな差が無い場合でも、得られる結晶の質が異なることがありえるということが、EtbCを使用した実験から示された。2.結晶化の方法の検討通常の条件でX線回折データを収集するには、結晶の大きさはある程度大きいほうが良い結果を与えることが多い。そこで、いったん結晶が得られた後、結晶化の方法を変更することで大きな結晶を得る試みを行った。その結果、良く用いられるHanging drop法の代わりにBatch法を採用することでより大きな結晶を容易に得られることが多いことが、BphC,BphD等を使用した実験から明らかにすることができた。

In this study, the methods for preparing high-quality crystals (BphB,BnzB,BphC,BphD,LigAB,EtbC, etc.) are discussed. 1. The purity of protein and the relationship between crystallization are discussed in detail. In many cases, the crystallization process and twinning process are used. In this study, the purification system of protein was discussed, and the formation of twins was inhibited. Specific BnzB,BphD and refining conditions were improved, and twin crystals were successfully produced. The crystallization conditions are the same, the purification conditions are different, the purity is different, the crystallization quality is different, EtbC is used. 2. Crystallization method of the general conditions of X-ray reflection, such as concentration, crystallization of a large degree of large, good results, and so on. After the crystallization, the crystallization method was changed. As a result, the Hanging drop method and Batch method are well used, and the crystallization method is easy to obtain.

项目成果

Sugimoto,K.,Senda,T.,Aoshima,H.Masai,E.,Fukuda,M.& Mitsui,Y.: "Crystal structure of an aromatic-ring-opening dioxygenase LigAB which is a protocatechuate 4,5-dioxygenase." Structure. (in Press). (1999)

杉本，K.，千田，T.，青岛，H.马西，E.，福田，M.

Sugimoto,K,Aoshima,H.,Senda,T.,Masai,E,Fukuda,M.& Mitsui,Y: "Purification and crystallization of a protocatecuate 4,5-dioxygenase LigAB from sphingomonas paucimobilis SYK-6" Protein and Peptide Letters. in Press. (1999)

杉本K、青岛H、千田T、马西E、福田M。

Mitsui,Y. & Senda,T.: "Elucidation of the basic three-dimensional structure of Type I interferons and its functional and evolutionary implications." J.Interferon and Cytokine Res.17. 319-326 (1997)

三井，Y.

Tanabe,T.,Tanaka,N.,Nonaka,T.,Mitsui,Y.,Yoshimoto,T.et al.: "Roles of the Ser146,Tyr159 and Lys163n the catalyticaction of 7α-hydroxysteroid dehydrogenase." J.Biochem.(Tokyo). 124. 634-641 (1998)

Tanabe, T.、Tanaka, N.、Nonaka, T.、Mitsui, Y.、Yoshimoto, T. 等人：“Ser146、Tyr159 和 Lys163n 在 7α-羟基类固醇脱氢酶催化作用中的作用 J.Biochem”。 （东京）124。634-641（1998）。

三井幸雄、千田俊哉、野中孝昌: "「遺伝」52巻,7号" X線で見る-生体高分子から生物マシーナリーヘ-, 6 (1998)

三井由纪夫、仙田敏也、野中贵正：《遗传学》第 52 卷，第 7 期，用 X 射线观察 - 从生物聚合物到生物机械，6 (1998)