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筋由来運動ニューロン栄養因子cDNAのマスタープレートからのクローニング

从母板克隆肌肉源性运动神经元营养因子 cDNA

基本信息

批准号：
08680900
负责人：
樫原康博
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Okazaki National Research Institutes
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

運動ニューロンの存在は、その支配標的器官である筋由来の栄養因子に存在する事が古くより仮定されているが、その実体は不明である。我々は、この分子のcDNAをクローニングする目的で、鶏胚下肢筋から得られたmRNAよりcDNAライブラリーを作成した。このライブラリーcDNAを1万pfuずつに分画し、それぞれの分画cDNAより作成したcRNAを、アフリカツメガエル卵母細胞に注入することで得られる翻訳分泌タンパクを自然細胞死期の鶏胚運動ニューロンに投与したところ無投与群に比べて有意にその生存が促進される分画を見いだした。そこで、これを3000pfuに希釈した分画を10個作り、その中に活性cDNAを有するファージが存在するかを同様の方法で検定した。生存活性の比較的強い分画をさらに1000pfu希釈したところ、生存を促進する分画とむしろ生存を抑制する分画を偶然得た。そこで我々は、生存促進分画とこの抑制分画の両者を並列してクローニングすることに決定した。それぞれを上記希釈法で分画し、最終的に両者とも200pfuまでに絞った。希釈法による分画方法では必ずしも活性cDNAを有するファージが分画に存在するとは限らないが、ファージの種類が多い場合はこの方法を採らざるをえない。しかし200pfuまで絞られたので、次に示す確実に活性cDNAファージは拾えるマスタープレート法に切り替えた。先ず、生存抑制因子を先に単一cDNA化する目的で、この分画のファージを150pfuずつ10個の寒天プレート(マスタープレート)に撒き、それぞれの活性cDNAファージの有無を検討し、強力に生存抑制を有するプレートを特定できた。そこで、この150pfuの寒天プレートのコロニーを1個づつ取り出し、各々を増殖させストックした。現在この単一cDNAを有するファージをグループ分けし、各々の活性を検討するという作業を繰り返しているところである。

The existence of the motor and the existence of the nutrient factors governing the target organs are unknown. We want to create a cDNA library for this molecule. The cDNA sequence of 10,000 pfu was generated by cRNA and injected into oocytes, and the results showed that the cDNA sequence of 10,000 pfu was secreted by natural cell death and embryo movement, and the results showed that the cDNA sequence of 10,000 pfu was significantly increased compared with the results of group injection. The 3000pfu cDNA fragment was identified by the same method. The survival activity is compared to the survival activity of 1000pfu. We will continue to promote the survival of the population, and we will continue to promote the survival of the population. The final result is 200pfu. The method of separation is to be used in different situations. 200pfu to the right, and the right to the left. First, the survival inhibitory factors were identified by cDNA sequencing, and then the expression of these genes was analyzed by 150pfu. Ten different genes were identified by cDNA sequencing. The presence or absence of these genes and the presence or absence of strong survival inhibitory factors were identified.そこで、この150pfuの寒天プレートのコロニーを1个づつ取り出し、各々を増殖させストックした。Now, the cDNA sequence has been modified to include the following components: