上皮細胞の極性分泌経路の起源-TGN-細胞表面間小胞輸送の分子機構-

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研究代表者が見いだした、繊維芽細胞における上皮細胞に類似したTGN-細胞膜間選別輸送について、研究計画に基づき解析を行い以下の成果を得た。1)これまでの解析に用いてきたBHKとCHO細胞以外にも、イヌの繊維芽細胞由来の培養細胞であるA72でもやはり上皮細胞に良く似た選別があり、先端面類似輸送と側底面類似輸送の2種類の経路が存在することを見いだした。2)当初の研究では、インフルエンザウイルス凝集素とセミリキ森林ウイルスE蛋白質を輸送のマーカーとして追跡してきた。しかしこれらのマーカー蛋白質は外来性であるので、実際に繊維芽細胞が自己の蛋白質を選別しそれぞれの輸送経路に乗せているのかを明らかにするため、内在性の細胞膜蛋白質及び分泌蛋白質を解析した。BHK細胞を^<35>S-メチオニンでパルス標識し、20℃で被輸送蛋白質をTGNに蓄積した後、フッ化アルミニウム存在乃至非存在下で37℃で細胞膜へ輸送させた。フッ化アルミニウムは側底面類似輸送を阻害するが、先端面類似輸送には影響しない。培養液中に現れた分泌蛋白質と、細胞表面のビオチン化で検出される細胞膜蛋白質を、2次元電気泳動とオートラディオグラフィーで解析したところ、全細胞膜蛋白質のうちの5〜10スポットと全分泌蛋白質の多くがフッ化アルミニウムに阻害されずに輸送されていた。従って繊維芽細胞は、内在性蛋白質についても選別を行い別々の経路で輸送していること、細胞膜蛋白質と分泌蛋白質では主に利用する経路が違うことが判明した。3)フッ化アルミニウム以外の薬剤について、この2種類の輸送経路に及ぼす影響を検討した。破傷風毒素とコレラ毒素はどちらにも影響を与えなかった。ブレフェルディンAは両方を阻害したが、先端面類似輸送の阻害が50%であるのに対して、側底面類似輸送はほぼ100%阻害した。分泌経路のオルガネラ内腔を酸性化しているV-ATPaseの阻害剤であるブフィロマイシンとコンカナマイシンはどちらも側底面類似輸送のみを阻害した。