ビタミンD応答配列(VDRE)の解析 positive vs negative VDRE

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ビタミンD応答配列(VDRE:vitaminn D response element)の機能を理解する上で、chick副甲状腺ホルモン遺伝子等でみられるDR3型のnVDRE(negative VDRE)が、正の応答性を示すVDREと構造が類似しているにもかかわらず応答が異なる機序を検討する必要がある。前年度は、DR3型nVDREのビタミンD応答性を検討したが、ビタミンD添加群は非添加群の85%程度の活性を示し、用いたnVDREの負の応答性が不十分であると判断されたので、今年度は、より負の応答性が明瞭な遺伝子プロモーターを得ることを目的として、ヒト1α位水酸化酵素(1αOHase)遺伝子プロモーターのクローニングを行った。BAC(bacterial artificial chromosome)system "Down to the Well BAC Human DNA Pools"(Genome SYstems Ins,)を用いて、既報告の塩基配列を利用してprimerを合成し、PCR screeningを行い、1αOHaseの上流を含んでいると思われるBAc cloneを決定した。1αOHase遺伝子を含む上流約3Kbpを切り出し、pGEM3zfにsubcloningした。その後、luciferaseをリポーターとするベクターに組込み、subcloningした1αOHase遺伝子5'上流域がプロモーター活性を持つことを確認した。COS細胞にビタミンD受容体(VDR)発現ベクターともに導入したが、1α位水酸化酵素(1αOHase)遺伝子プロモーターのビタミンDの応答性は認められなかった。ビタミンD応答性が細胞特異的である可能性があるので尿細管細胞を用いる必要がある。また、VDRの導入のみでプロモーター活性の低下が認められたので、1α位水酸化酵素(1αOHase)遺伝子プロモーター活性の負の制御が、リガンド非存在下でみられる可能性が考えられた。