Establishment of a novel Developmental RNA Biology field under hypoxia by using dual fluorescent color based splicing reporters

利用基于双荧光颜色的剪接报告基因建立缺氧下新型发育RNA生物学领域

• 批准号: 22K19239
• 负责人: 片岡 直行
• 金额: $ 4.16万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19239/
• 关键词: 低酸素応答; 転写後調節; RNAスプライシング; レポーター; 細胞分化; Rbbp6; TS細胞; 低酸素; 胎盤発生; ポリA鎖付加; 蛍光タンパク質

低酸素応答は外界からのストレスへの応答機構の一つで、細胞が低酸素条件下に曝されると細胞の代謝・呼吸を調節して、恒常性の維持に働く。また発生段階のシグナルとしても重要であり、ヒトやマウスの初期の胎盤形成は、子宮内の低酸素環境下で進行する。低酸素応答では、様々な転写因子による転写調節がよく知られている一方、転写後調節過程である選択的スプライシングにどのような影響を与えるかについては、ほとんどわかっていなかった。そこで、マウスN2A細胞を用いて、低酸素条件下で選択的スプライシングが変化する遺伝子を網羅的に解析した。そして、最も大きな変化を示す遺伝子として、Retinoblastoma binding protein 6 (Rbbp6)を同定した。常酸素下では、すべてのエクソンを含んだiso1が優位に発現するが、低酸素下ではエクソン3下流のイントロン内でpoly(A)鎖付加が起きた短いiso3の産生が増える。そこで神経細胞やがん、および胎盤細胞など様々な細胞や組織でバイオマーカーとして使用できると考え、低酸素応答を示す転写後調節モニターレポーターの構築を試みた。まず、Rbbp6の選択的スプライシングを受けるエクソン2からエクソン4までのゲノム領域をクローニングし、このレポーターをマウスNeuro2A細胞、NIH3T3細胞、TS細胞に導入し、iso1型とiso3型の両方が産生されることを確認した。iso3の発現には、イントロン内でpoly(A)鎖が付加される必要があるが、そのために必要な配列はまだ同定されていない。そこで、iso1, 3の発現に必要なイントロン内配列を探索する目的で、上記のレポーターに様々な欠失を導入したものを準備した。また、Rbbp6 iso1, iso3の細胞内局在や機能を調べる目的で、それぞれのcDNAを用いて発現ベクターを構築し、培養細胞での発現を確認した。

Under the condition of low acid concentration, low acid concentration, low acid concentration, During the period of pregnancy, the pregnancy should be carried out in the early stages of pregnancy, in the early stage of pregnancy and in the environment of low acid content. The low acid content is very important, and the writing factor is very important. You should know that you are not aware of the information on the other side, and that you have selected the information after the process. Under the condition of low acid, the selected cells will change the resolution of the Internet subnetwork. For example, Retinoblastoma binding protein 6 (Rbbp6) is the same as that for each other. In the normal acid, there is an increase in the temperature of the iso1, the position of the iso1, the low-acid, low-acid, low-acid, The tissue of the baby, the cell, the cell. The location of the Neuro2A cell, NIH3T3 cell, TS cell, TS cell, isotype, iso1, iso3, iso1, iso3. Iso3 is required to receive additional information from poly (A), which is necessary, necessary, and necessary. For example, iso1, 3, please add the following columns in the necessary information: explore the purpose, go to the top, and prepare for the missing. The local office of the computer, Rbbp6 iso1, and iso3 can verify the performance of the computer by using the computer, the computer, the cDNA, the computer, and the computer.